干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 高手请进！脐带间充质干细胞组织块法分离失败。第3-5天组织块间很多膜状沉积，求解... [打印本页]

作者: quge_00 时间: 2012-7-9 11:21 标题: 高手请进！脐带间充质干细胞组织块法分离失败。第3-5天组织块间很多膜状沉积，求解...

本帖最后由 quge_00 于 2012-7-9 11:22 编辑

谁能帮看看我的实验步骤：3-5cm的wharton胶养一个60mm的培养皿。! G" C W( Q9 B0 |3 i
1、无菌收集脐带，浸没于含1%双抗（青链霉素）的4℃预冷PBS中，清洗表面血污； - Q3 W1 B0 H2 `, l/ d
2、灭菌棉线结扎脐带一端（1cm处），另一端固定于超净台，将脐带浸入4℃含双抗PBS的灭菌容器中；
3、超净台内用手术刀片环切距线结端约0.5cm处脐带外膜（勿环切过深），用皮钳将脐带外膜整张钝性剥去；止血钳钝性剥离2根动脉和1根静脉；
4、距线结端约0.5cm处切断血管和华通氏胶，再次用含双抗冷的PBS洗净血污。将华通氏胶剪碎至约1mm3，转移到50ml离心管，用PBS以1000rpm两次洗去粘液；
5、将组织块转移到细胞培养皿中，使组织块分散平铺在培养皿上，间距为5mm，入37℃、5%CO2孵箱培养30-40分钟使组织块贴壁； & i9 T5 @, Y, C% g3 |0 W* s) d8 ]& K
6、加入DMEM/F12培养基（含10% FBS）6ml后，入37℃、5%CO2孵箱培养，5天后半量换液。

作者: quge_00 时间: 2012-7-9 11:38

养3-5天，组织块间就开始有一层膜状物，没有细胞结构，像是死细胞或者是蛋白沉积，一晃动就能剥落下来一层。但是总是很多，显得很脏（换培养液是感觉很粘稠，像胶水一样）。已经养了4批了，只有一个培养皿像是MSC，但是可喜的是还没传代就莫名其妙的死掉了。。。9 q; @- P$ m y! |) e
换过FBS，培养液需要换a-MEM吗？

作者: quge_00 时间: 2012-7-9 11:47 标题: 底面观

本帖最后由 quge_00 于 2012-7-9 11:55 编辑 % C1 L% E# |2 _4 @. |# ?7 x
& a) c; w. h( c2 k3 L
底面观

作者: quge_00 时间: 2012-7-9 11:58

正面观

作者: quge_00 时间: 2012-7-9 12:01

现在问题是这层膜怎样处理呢，挂掉害怕组织块松动；留着的话细胞是不是没地方长了？5 _; o$ c# U# F+ @1 P& s
最要紧的事显微镜已经很难透光了。。。。。。! l+ t( f5 }; c' {- R- t% [
高手速来，
感激不尽啊。。。

作者: xxuudd 时间: 2012-7-9 12:36

怎么会有膜呢？是污染了吧？3 \6 c ?8 h' [

作者: 单个核细胞 时间: 2012-7-9 13:00

本帖最后由单个核细胞于 2012-7-9 13:04 编辑 4 ^; N+ k6 o ~5 D! K

回复 quge_00 的帖子
& R' v9 A$ G! H# V5 f$ v
推测为污染，建议重做。# V9 w$ r* c3 d1 ]: Z1 u8 q
6 ^5 e% y. }0 I1 P) S5 X0 s& z
你可以这样试一下，不要剥外膜，先将脐带剪成小段，然后组织镊剔除动静脉，直接剪碎，贴壁5小时后加入完全培养液，静置培养。, a$ \ ?- \- a) I

熟练之后再行脐带华通胶组织块贴壁培养。

作者: sdwzg119 时间: 2012-7-9 13:46

本帖最后由 sdwzg119 于 2012-7-9 13:48 编辑 4 G. U4 l9 L3 V/ q
1 k1 W# L- |5 j' P" F8 E Z. U
回复 quge_00 的帖子 B7 r' p" ]% ^6 _ y: f

不会有膜的，我认为你这是污染了，现在组织块贴壁法样脐带MSC挺成熟的。
你描述的3-5天有白膜长出，这个时间正是细菌生长出的时间，你连续四次都这样，说明你无菌处理的非常不到位。
1 W7 S; `* N7 T% }* t# q
脐带，你光指望双抗水是不行的，它可能有非常多的真菌，我建议你多冲洗一下，起码冲洗10遍以上，去脐带的两头。

作者: quge_00 时间: 2012-7-9 15:40

回复 xxuudd 的帖子

谢谢！最近整个培养箱都出问题了，污染也非常可能。。。

作者: quge_00 时间: 2012-7-9 15:43

回复单个核细胞的帖子- p. N+ G; @; |7 i' M. r: o

非常感谢~~~最近整个培养箱都出问题了，我想也很有可能污染（还有几次长出霉菌菌落）。。。弱弱的问一下：粉碎后静置5小时不怕组织块干掉吗。。。。？？

作者: jiefengbing 时间: 2012-7-9 15:46

长成这样基本都是污染了，操作的时候注意无菌

作者: quge_00 时间: 2012-7-9 15:47

回复 sdwzg119 的帖子
2 ]1 ]8 F2 x8 W) q% }# B
非常感谢~~~最近整个培养箱都出问题了（细胞都长得很差），我想也很有可能污染（还有几次长出霉菌菌落）

作者: Tim 时间: 2012-7-9 17:25

回复 quge_00 的帖子
6 w2 T9 } d' K0 {$ y
不要着急要组织块贴壁，处理完的块先拿培养基浸泡2到3天，然后在离心洗涤那些所谓的黏液!次数自己掌握！然后再抱被贴壁养细胞！（浸泡组织块的培养基里加抗生素），，，，，3天后你就应该可以看到细胞从组织块爬出！注意培养基血清浓度！我一般用15%FBS.........

作者: quge_00 时间: 2012-7-9 17:45

回复 jiefengbing 的帖子, o7 r+ O4 q- W' a- F R9 {

学习了~~

作者: quge_00 时间: 2012-7-9 17:53

回复 Tim 的帖子 | ]# l0 \8 B) L

非常感谢~~你的方法很有启发性~目的是让等基质里蛋白渗出差不多了，再去让组织块贴壁，对吗?7 e+ ~6 y, i4 |5 K2 Z) ]
还有几个问题：
1、组织块粉碎大小大约是多少呢,1mm3 ? 3-5mm3 ?看很多文献报道不一。
2、培养液里血清浓度为15%，还需不需要其他什么添加剂了呢？比如我看有人加地米、Vc等。您的经验呢？期待您的答复~~~

作者: 493512112 时间: 2012-7-9 18:42

这个明显污染了哦

作者: sdwzg119 时间: 2012-7-10 09:17

回复 quge_00 的帖子/ g0 H5 C1 @( L; i

我们都是静置过夜以后才加培养基的呢~~~！！不会干的~

作者: Tim 时间: 2012-7-10 11:19

回复 quge_00 的帖子% m. l* D( S' p; T) h
+ ^! I0 j2 Q# Y- U, ]( j
不客气！互相学习嘛!块越小长的越快！这是我的经验！贴壁的块不要太多40%就好了！其它的东西没有添加！

作者: 单个核细胞 时间: 2012-7-10 16:46

回复 quge_00 的帖子, z* M0 e$ W5 h1 ?8 h! Q
1 m, ^/ ~+ W2 c% H) x0 z9 q6 T
没事的，培养箱里面有水盘，湿度大（所谓的“饱和湿度”），5小时不会对贴壁的组织有影响，甚至可以过夜后补加培养液。

作者: leostar131 时间: 2012-7-10 20:30

回复 quge_00 的帖子 I, o$ j/ L& u% f" l% \7 v" i1 e0 S" g

若长霉菌，要用两性霉素彻底擦拭培养箱，且在制备脐带细胞时也要用两性霉素

作者: quge_00 时间: 2012-7-10 21:14

学习了~~~

作者: quge_00 时间: 2012-7-10 21:15

本帖最后由 quge_00 于 2012-7-10 21:17 编辑 1 ~4 Y1 U4 H: M7 t8 S
. _/ `( X; @; Q) E, r9 x
回复 leostar131 的帖子' b5 N9 m% s* D( S9 Y4 ~ r8 b. f
/ K7 V q1 o* \" _5 a7 m
多谢指点啊~~霉菌像是脐带带进去的，同一个培养箱的其他细胞张的也很差（不过没有出现菌落而已,培养液还算清亮）。看来得彻底大扫除了啊~~~

作者: quge_00 时间: 2012-7-10 21:26

回复 leostar131 的帖子

多谢指点啊~~~
您在处理脐带时是在超净台还是生物安全柜呢？？( \1 q5 b! B& n! t, a- V% B+ Y
处理脐带时间有时会很长，是不是要时不时的用两性霉素冲洗呢？( r0 k; P; _$ g
需不需要将两性霉素加到培养液里去呢？？

作者: leostar131 时间: 2012-7-11 23:06

回复 quge_00 的帖子

你取的脐带是输血前五项都是阴性吧？这样的话超净台就够了，有条件安全柜更好，两性在撕脐带时不用，双抗和两性可以在你加胶原酶这一步加

作者: leostar131 时间: 2012-7-11 23:07

回复 quge_00 的帖子

必须大扫除，用两性擦拭培养箱

作者: quge_00 时间: 2012-7-20 16:17

回复 quge_00 的帖子8 o1 a* ]$ n9 T/ `3 K* K, H6 i

把培养基接空培养皿种放到培养箱培养后，发现类似的浑浊，原来是7月3日当天配制的培养液已经污染了。。。。。丢弃重新配制！！！！

作者: deshenglll 时间: 2012-7-23 14:40

洗干净了没有，好像血细胞比较多。

作者: deshenglll 时间: 2012-7-23 14:42

有霉菌细胞也会长的。组织块培养一般5天左右就可以看到间充质细胞了。希望你好运。

作者: jxaf3900824 时间: 2012-7-24 10:19

污染啊,难道你用显微镜看不出来....

作者: quge_00 时间: 2012-7-25 11:44

回复 jxaf3900824 的帖子
. }' a5 M" b5 Z$ u7 `
其实不用显微镜反而能看出来~~~
显微镜已经不能透光了。。。! U; R6 j- U0 b- x
不是霉菌污染，霉菌培养液比较清；像是细菌污染，浑浊的很，皿底一层粉红色细颗粒状的沉积层，可以晃动，像流沙一样，不知道是什么细菌。。。反反复复污染的就是这一种，很好奇是什么细菌~~~

作者: zhang0194 时间: 2012-7-26 16:26

看了你的图片，组织块有点大，密度也大，几乎组织块之间没有间隙，细胞游离出来很困难。. c$ V0 U3 m8 j" W i7 p
建议你把组织块剪碎至 3-4mm大小，每块组织块相隔1CM 左右铺展，尽量使组织块和培养瓶全接触（用瓶子吧，平皿容易污染）。5天换液，10天左右就长出来了。

作者: quge_00 时间: 2012-7-26 17:37

回复 zhang0194 的帖子4 G4 N( q. T" k* h$ }/ W/ i: Y; N
3 l6 f3 N' J6 z
培养瓶的话组织块很难排列整齐啊，
瓶口感觉也容易配污染呢。。。; x- \" Q" ]3 t1 r) r
你有什么小窍门吗？

作者: zhang0194 时间: 2012-7-29 10:50

回复 quge_00 的帖子9 N0 m9 G, Z- h/ P9 L; B
( S, O. Q! p* U* P- \/ G
用5毫升的移液管拨，别用太多的培养液包被，24H后在添加培养液。

作者: quge_00 时间: 2012-7-29 17:03

回复 zhang0194 的帖子4 x( h; `# [, e1 Z: H& a+ |8 i
+ i% v7 o) Z+ S: [1 A# K
是哦，这样一来挺不错的，下次试试培养瓶~~
我们实验室都是10ml的移液管，买点5ml的试试~~~
谢谢啊~~* P# e: B& s3 F2 N

作者: ld2069 时间: 2012-8-7 09:09

考虑为污染可能性比较大，脐带运输过程中是否存在某些环节容易造成污染呢？以及处理过程中的污染问题。

作者: 透明之蓝 时间: 2012-8-7 16:17

1.真菌或细菌污染？
2.血细胞多？4 }$ P$ s' S6 U& i
第一个可能性较大

作者: 透明之蓝 时间: 2012-8-7 16:27

本帖最后由透明之蓝于 2012-8-7 16:30 编辑 4 c" S% r2 M* X: \* X( P1 A
* R0 \! I0 I" }
回复 quge_00 的帖子
. o7 v$ w Q6 z* F2 L6 x4 N+ e* Y
这样，来的脐带，直接上双抗太弱了！$ A- D: _# u. Q- x" O
现在剖腹产的多，顺产的少，剖腹产的时候，是由外科来负责，和产科无关。
而胎儿娩出后，因为你拿到脐带都是“偷偷”拿的，所以产科医生和护士没法立刻进行处理，他们还要测量胎儿的一些参数和对胎儿、产妇进行处理；而外科的护士一般都会把产科检查后的胎盘（包括脐带）直接扔到手术室的地上，虽然是等级很高的层流净化实验室，但是也是有细菌的！等到你拿到脐带的时候，通常都是污染的！
这个时候，先把脐带用生理盐水冲洗干净，然后整条浸泡到75%的酒精中，10min左右，然后拿出来无菌条件下剪成2-3cm的长度，再用新的75%酒精洗去残留的血迹，挤出血管中的血，然后直接剥皮，这个时候由于酒精的浸泡，外皮会皱缩，也有利于剥皮，先剥去外皮，然后除掉静脉（最大、最薄的），然后是2个动脉（很好去除，放在后面剥离），然后撕成5*10-20mm的大块，贴壁培养即可。剪的太小了，加培养基或者补液、换液时容易漂起来·，就白费了~~, I$ i2 w& m2 D. o
后续培养基中原代培养还是添加双抗吧，后面再说~~

作者: 透明之蓝 时间: 2012-8-7 16:33

回复 quge_00 的帖子' ?- w' X0 H2 X1 G
9 _6 j( \7 Q/ V1 ^. _
买些血平板，很便宜，几块钱一个，每次配液做个质控！

作者: quge_00 时间: 2012-8-7 19:17

回复透明之蓝的帖子, z8 v$ D+ ], o A

受教了啊~~~+ e! F, a7 v4 H/ w# ?, A" G
我现在已经开始用酒精消毒脐带了~~
基本没有再出现过污染了~~
8 o- R2 V, a! G8 [/ F

作者: cjsbaicai 时间: 2012-8-15 17:37

我做了好多次，都没出现这种情况。不过我们一般是5天左右全量换液，时间也不是固定的，主要看细胞贴壁情况。原代的话一般培养15天左右

作者: quge_00 时间: 2012-8-15 18:37

回复 cjsbaicai 的帖子
1 }, T+ q8 b8 r7 k% J; y" T
是的已经确定是污染了。改进无菌操作技术后，现在也在没有出现过类似情况。我们也是2周左右出细胞，4周左右传代~~~~

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)