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标题: 荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法 [打印本页]

作者: l19rna 时间: 2012-7-14 16:01 标题: 荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

本帖最后由 l19rna 于 2012-7-14 16:05 编辑

最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？
# X; Z' {6 o8 D* `3 ^6 N: _- R* y+ `
看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。3 n1 i u" U# m
不知道是否有探针数据库可以查询？
2 {( i' L1 ?) I. M! B
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？
$ ]- `, @0 b: U) V: K
求高人指导~

作者: 妖妖空 时间: 2012-7-14 22:52

NCBI不行吗？

作者: l19rna 时间: 2012-7-14 23:06

回复妖妖空的帖子
) I( x1 ?# \* O) o
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

作者: weiyepan 时间: 2012-7-16 21:27

本帖最后由 weiyepan 于 2012-7-16 21:32 编辑 ! f7 i: m4 Q( h
) ^: k$ n. k* t* M. C% e
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。' T1 o7 c/ L3 `9 O- b( J3 i
用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。% j% ?$ X) P; _ [( M) R# w
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。

standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

附件: standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (2012-7-16 21:30, 53.03 KB) / 下载次数 281
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NDQyNTV8MWM0N2ZjM2F8MTc5MjczNTQ2NXww

作者: l19rna 时间: 2012-7-16 22:06

回复 weiyepan 的帖子8 Y, r+ n- T% K
9 z9 t" U( v: W0 f
果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

作者: kkmmkkmmkk 时间: 2012-8-22 09:51

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 ! }) z6 k9 H5 k( U+ E1 K1 \
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

作者: 细胞海洋 时间: 2012-8-23 12:29

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作者: s1002297748 时间: 2012-9-28 15:07

给力

作者: huangxf1998 时间: 2012-9-29 08:17

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。9 j5 L, B/ @$ c( f; o7 [
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。' Y$ L+ J: a$ ]# B. G; }
几点注意： J0 Z: m' Q( Q( I
1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。4 g# q7 B3 r; H% U0 b
2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。

作者: l19rna 时间: 2012-10-13 22:37

回复 huangxf1998 的帖子- Y+ p. X# z9 { b! {. J" Z; q
+ \, V; [" t; k5 `2 r
第一次已经失败了啊，唉，呵呵

作者: xxp1246087085 时间: 2012-12-19 23:46

准备做RNA FISH，白手起家啊

作者: l19rna 时间: 2012-12-24 14:41

回复 xxp1246087085 的帖子
) c% b6 `6 E3 J
兄弟加油，我已经搞定了

作者: xxp1246087085 时间: 2012-12-24 18:27

回复 l19rna 的帖子

以后还要多多请教啊

作者: l19rna 时间: 2012-12-27 18:41

回复 xxp1246087085 的帖子4 {' d) I7 y7 e) R( T" y

我现在只会做whole mount ISH of mouse embryo，不知道能不能帮到你了，呵呵

作者: xxp1246087085 时间: 2012-12-30 13:44

回复 l19rna 的帖子( ?- D. R. K( ~8 h* a8 L
: ^5 D& h/ w/ l, O. H
我现在设计的500bp长度的探针，末端会有1-2bp的不匹配序列，不知道对结果有影响没有，我用的RNA探针

作者: l19rna 时间: 2012-12-31 12:40

回复 xxp1246087085 的帖子
9 o# X) i; b# N
木有影响，放心吧。你做体外转录时候还有载体上的一小部分序列呢，不会影响结果的

作者: flybear 时间: 2013-1-2 20:46

FISH要求的长度是1000-1200bp左右吧，如果做细胞的可能要考虑你的转化效率了！！！片段太短，特异性很差，这个楼主要考虑了！！！

作者: flybear 时间: 2013-1-2 20:47

做这种fish，先弄最好做的，比如actin等，做个阳性对照了！！！出来了，再做目的基因的！！！！

作者: l19rna 时间: 2013-1-3 12:27

回复 flybear 的帖子
% W- j: n1 G& ]2 m* U, N- ]
嗯嗯，非常感谢分享经验

作者: xxp1246087085 时间: 2013-1-12 12:40

谢谢大家，这两天忙考试了，没上网，非常感谢

作者: xxp1246087085 时间: 2013-1-12 12:41

谢谢大家，这两天忙考试了，没上网，非常感谢

作者: hn1022 时间: 2013-1-18 16:06

我也要做胚胎的RNA FISH ，想请教一下protocol呀！谢谢

作者: l19rna 时间: 2013-1-18 20:40

回复 hn1022 的帖子- y; ^6 y( {' p D% F& H. R. r: U

不同天数的胚胎的ptotocol会有细节上的差别，我做的比较早期，建议参考nature protocol上的文章： ! U9 ~7 F: O& x8 O# q2 s7 q
Title：An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies

作者: 无心 时间: 2013-6-26 15:02

作者: 无心 时间: 2013-6-26 15:03

想了解

作者: icebaby 时间: 2013-8-6 00:58

做ISH，最常用的还是Riboprobe吧？我想FISH也应该是这样的。我最近要做ISH，探针的话想找个公司来做。

作者: doctorrobin 时间: 2013-8-6 14:21

我想请教一下想做一个对照内参探针找什么基因比较好本人刚接触ish

作者: 细胞海洋 时间: 2013-8-6 23:47

回复 doctorrobin 的帖子
8 N( N$ u& |% L4 \
建议你发新帖提问

作者: l19rna 时间: 2013-8-7 07:43

回复 doctorrobin 的帖子& V1 Q: H( n) `+ X0 C3 V8 K* ]
$ G2 O% W4 }/ c0 m; o% `
我一般是用别人已经发表的探针，而且其表达谱是公认的，才用来做阳性对照；
阴性对照就选择cRNA的互补序列，这个在你的cRNA载体上转录出来就行。

作者: l19rna 时间: 2013-8-7 07:47

回复 icebaby 的帖子- n& b! x8 I( ]6 M* H
1 H3 N" K( @9 \' o- I
FISH已经有很多更高效的方法。尤其是做单细胞且定量的FISH。其探针也有很多种，除了传统的，还有50bp长度，19-24bp长度探针，等等

作者: yunzihao1 时间: 2013-8-20 22:38

谢谢楼主，真厉害

作者: caomin307 时间: 2013-10-13 10:15

FISH探针的长度一般为300bp-1kb，标记方法主要有缺口平移法(nick translation)和随机引物法(random primer)两类技术。
. b: o/ n5 L9 c Z. x7 ^
使用缺口平移法制备，在极微量DNA聚合酶的作用下，在双链DNA分子的一条链上切开若干个缺口，然后，大肠杆菌DNA聚合酶I在切口的3’-OH端逐个加入新的带标记的核苷酸，同时由于该酶具有5’-3’外切酶的活性，它同时切除5’端游离的核苷酸，3’端核苷酸的加入和5’端核苷酸的切除同时进行导致切口沿着DNA链移动，最终形成高比活性的均匀标记的DNA探针，用于荧光原位杂交相关实验。根据这个原理，如果用高强度的放射性核苷酸（通常为α-32PdATP）置换先前存在的核苷酸，则可制备比活性高达108cpm（每分钟计数）/μg的32P标记DNA。用缺口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交要求。

作者: sparetire 时间: 2013-10-18 04:18

这个帖信息量好大。

作者: crazybacter 时间: 2014-3-6 22:28

回复 l19rna 的帖子: b3 E5 c2 _; f+ T. |; Q% H9 r

我也想知道怎么弄

作者: xigua111111 时间: 2014-10-21 19:17

新手一名请求指导如何设计RNA fish 探针？类似于引物设计？长度之类的也都类似？新手求指导谢谢！！！

作者: rudyhit 时间: 2014-11-5 16:13

顶，好东西啊！

作者: hiyellow 时间: 2015-4-2 12:12

最近也准备做这个

作者: wzttray 时间: 2015-4-7 20:16

谢分享

作者: wzttray 时间: 2015-4-7 20:16

附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

作者: wendy24shi 时间: 2015-4-23 21:27

这个正好用到

作者: syczysyczy 时间: 2015-4-27 16:19

有用

作者: Vera-go 时间: 2015-5-21 16:27

希望我能尽快学到无私队友们的宝贵经验

作者: yuanyecat 时间: 2015-5-26 18:05

有以下几个方法，$ {# a- g9 y! d/ t# y# P
1，用软件自己设计，但是要验证。& @- n5 Z' _5 D( g
2，在公司买探针，这个不需要验证，而且已经被验证了; v5 W, d5 R- j `; y7 S
3，在NCBI搜基因相关的探针，这个是被其他研究人员验证过了。

作者: syczysyczy 时间: 2015-6-15 16:41

公司基本上只负责合成

作者: 西梅 时间: 2015-6-30 17:20

怎么赚取包包？

作者: 细胞海洋 时间: 2015-7-1 07:35

回复西梅的帖子" j) L$ S9 y/ {2 E8 A9 G" |
k0 q+ v' S+ k1 t. \' S3 y
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作者: 6101 时间: 2015-8-6 16:37

看看

作者: 816 时间: 2015-9-17 20:54

不知道设计FISH探针难不难，会不会要花很多钱啊

作者: 816 时间: 2015-9-18 09:33

不知道如果是做mRNA定量的话，应该设计什么样的探针，是cDNA探针还是RNA探针？

作者: xcf20305 时间: 2015-9-24 11:49

探针一般使用RNA探针，
探针长度：300bp左右为宜，4 Q" u/ l; g1 d3 s+ d0 i- j/ q

作者: lada111 时间: 2015-10-13 10:12

great！！！

作者: 伊沫 时间: 2015-10-14 12:08

我探针长度25bp，杂交后检测的话会不会信号特别弱

作者: htt123456 时间: 2015-11-18 17:33

回复 weiyepan 的帖子

高手

作者: htt123456 时间: 2015-11-18 17:34

怎么下载附件啊

作者: 细胞海洋 时间: 2015-11-19 14:13

回复 htt123456 的帖子

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作者: anyianyi 时间: 2016-1-16 15:09

谢谢，收了3 W0 a; M; g3 A( T; R: K! u

作者: 534720018 时间: 2016-7-7 15:49

学习学习

作者: smallboar 时间: 2016-8-9 14:03

学习啦！非常感谢前辈们的经验。

作者: fudandan 时间: 2016-8-16 15:06

回复 weiyepan 的帖子% N9 g. \4 b a' y6 Q: T8 z
: \9 R" g& Q+ w- s0 ]
最近正在研究fish，对我来说有点难

作者: fudandan 时间: 2016-8-16 15:12 标题: RE: 荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

我也想下载那个pdf文件

作者: nankaizll 时间: 2016-8-19 02:54

学习了，谢谢！

作者: sukrit203 时间: 2016-9-23 10:37

求包包。。。

作者: kidult0409 时间: 2016-10-13 09:32

为什么下载不了那个protocol

作者: plusdeng 时间: 2016-12-5 09:50

我们自己做的FISH探针同样条件下100bp长的目前还不行，300-1000的各种拖带的倒是可以，杂交条件会不会对此影响很大，我还有必要摸一下100bp长的条件么

作者: wjl 时间: 2016-12-5 23:42

来看看

作者: yanlizhao 时间: 2016-12-27 23:49

nihao

作者: luomengwu 时间: 2017-2-25 15:44

请问各位大神，自己设计要如何设计？希望能详细点$ A; K! t {, l, s
如果要搜别人已经做过的探针要如何搜索？

作者: MR.Chan 时间: 2017-4-22 20:00

没有威望怎么下载

作者: 细胞海洋 时间: 2017-4-27 22:29

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作者: 细胞海洋 时间: 2017-4-27 22:29

回复 MR.Chan 的帖子& s, ^* C& P# z* M0 D

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作者: 开始懂了0962 时间: 2017-7-24 09:56

正在学习

作者: w1986725 时间: 2017-11-10 15:24

xiexie

作者: yqw1996 时间: 2017-11-22 13:19

没有威望下载不了

作者: songmanba 时间: 2018-3-11 08:06

我也在学习FISh，感觉好复杂啊，求大神指导。

作者: songmanba 时间: 2018-3-11 08:27

冯绍峰是否是发生

作者: ajiaozi 时间: 2018-3-22 10:44

( m- O- |! J9 O: K6 I7 S1 e
我也在学习FISh，求大神指导。

作者: Bingo614 时间: 2018-4-7 16:34

有用荧光标记的三相寡核苷酸探针的吗

作者: Bingo614 时间: 2018-4-7 16:38

回复 huangxf1998 的帖子
, I, P. E# k$ G& A8 \3 j2 w
您好，我做的一个400bp片段的基因比前人研究表达的位置更多了，这种情况需要再从400里选取部分片段进行实验，还是选取400之外的进行实验啊？请前辈多多指点

作者: xiasang0506 时间: 2018-5-22 21:27

+ Y6 G0 B+ Y3 a" i
第一次已经失败了啊，唉，呵呵

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