干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站
标题:
菜鸟的烦恼
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作者:
余冬冬
时间:
2012-7-15 19:34
标题:
菜鸟的烦恼
小弟是刚做的精原干细胞相关课题，因为过去不是弄这个的，所以很多都不懂，菜鸟一个。希望各位大侠能给些指导和建议。
- V$ d/ n9 B8 K9 ~
我按照机械分离和酶消化法分离提取到的小鼠精原细胞，再每隔近40min差异贴壁，一般差个3、4次，但是从那之后，基本上细胞就没啥动静，也不知道该不该换液。各位都是几天换一次液，换液时需要离心吗？原代细胞要不要加抗生素，一般多长时间会出现克隆呢？我用的是普通的DMEM,一般是10%的血清，没有加细胞因子，但是感觉细胞基本不长。
( n% F7 U' P; ]5 ]6 z' N% ]6 H( ~
作者:
pailishi
时间:
2012-7-16 08:33
应该加生长因子的
作者:
素心无痕
时间:
2012-7-16 09:11
如果不添加生长因子，细胞如何进行定向生长？你的DMEM是不是仅仅用于对照会好一些
作者:
chenchunlei
时间:
2012-7-16 09:12
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余冬冬
的帖子
5 p5 w9 v' e+ m4 \+ f
& L i; o7 |. v2 O% ~( Y- }4 E2 B
楼主几天的小鼠消化的？
作者:
余冬冬
时间:
2012-7-16 14:34
6-7dpp
作者:
余冬冬
时间:
2012-7-16 14:37
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素心无痕
的帖子
: G- v+ U7 _) D2 S' r
) A% Z' Y8 e8 t
我也想加，可是老板让我先不加试试，看能否出现克隆团，而且，我也不需要定向分化，只要能将干细胞富集，形成克隆团，接着就转染病毒了。关键是，养了那么多天，也没啥动静。
作者:
余冬冬
时间:
2012-7-16 14:37
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chenchunlei
的帖子
* G( u4 P: \8 h
9 a! G6 V0 @; p! i# o- A6 d$ {
出生后6-7天的小鼠，昆白系。
作者:
chenchunlei
时间:
2012-7-16 19:23
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余冬冬
的帖子
6 M# w" M: Z+ I
" |2 m( _. q) a; U' O
楼主贴壁后
( [7 B8 q, }# ~
阳性率能达多少？
' {* a* b* h& E8 K, b N) x
作者:
余冬冬
时间:
2012-7-17 17:23
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chenchunlei
的帖子
: m8 r8 t" {0 @6 { R0 j1 Y
( y9 F! \, d6 k u5 g, r0 J$ \ p$ T" O
请教一下，你说的阳性率是指？
作者:
hcluo
时间:
2012-7-19 09:14
本帖最后由 hcluo 于 2012-7-19 09:14 编辑
' x7 Z- ~% J; h9 x
5 s$ i2 b$ r+ l7 a: d
建议采用Brinster提供的经典的分选方法，就是利用SSCs的特异性表达标志物Thy1做MACS分选，这样可以提高细胞分选的纯度，而且饲养起来相对要容易，这样可以尽可能的排除Sertoli 等细胞的对SSCs生长的干扰。另外，细胞培养的时候还是建议使用饲养层以及加入一些生长因子，比如LIF，GDNF等。祝好运。
作者:
余冬冬
时间:
2012-7-19 10:14
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hcluo
的帖子
6 D* }' j& u1 `4 O
2 L. i$ A9 h `+ k# W' a1 a
感谢你的建议，可是目前还难以具备上述条件，只能走一步算一步啦，谢谢！
作者:
hcluo
时间:
2012-7-19 22:15
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余冬冬
的帖子
; I7 j0 S0 S2 _) |$ }* n6 i
3 X9 V. p! _2 @8 j! Z0 m* N
不用客气，以后有什么问题可以多多交流。
作者:
余冬冬
时间:
2012-7-20 08:42
先在这里说声谢谢啊，以后还会有很多问题要请教的！
作者:
精神病院小萝卜
时间:
2012-7-23 19:42
精原细胞本来增殖就慢，更何况你是原代，加着GDNF照看不好都能分化掉你不加还想看到克隆？而且养精原细胞怎么能用这么高的血清呢，精原的培养液基本都是血清free的或者1%血清的，血清太高了很快就分化了，另外6~7天小鼠根本不用每三到四个小时就富集一次，只要在过夜后富集一次就好了，之后就要有耐心了，一般第一代要到10天以后才能看到克隆出来，建议培养液里该加的成分都加加齐吧~
作者:
余冬冬
时间:
2012-7-25 11:25
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精神病院小萝卜
的帖子
4 O/ V/ x: z8 d' f2 e1 {2 y6 s
u3 r1 S% J' H. M
太感谢啦，只是不知道培养液里还应该加哪些东西？
作者:
精神病院小萝卜
时间:
2012-7-26 13:04
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余冬冬
的帖子
2 V$ U3 P- L5 r) B; h
* i$ U, g2 [. c# O
一般用无血清的培养液，加BSA供应营养，然后抑制分化的因子，GDNF,bFGF,EGF,建议你看一下宾夕法尼亚大学 Brinster实验室的文章，有培养液配方~
作者:
余冬冬
时间:
2012-7-27 15:12
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精神病院小萝卜
的帖子
# J' j* l3 t- S S9 t
- _0 K5 e! H: k4 ], j" @
太感谢你了，谢谢！
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