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标题: 大家帮我看看我的原代大鼠MSC [打印本页]

作者: huajie881026 时间: 2012-7-17 23:20 标题: 大家帮我看看我的原代大鼠MSC

本帖最后由 huajie881026 于 2012-7-17 23:33 编辑 5 G: [( x) ?4 S& z

7周龄SD大鼠，双侧股骨+胫骨培养在T25培养瓶，48小时首次换液，蛮5天时第二次换液，今天第六天，感觉细胞不像论坛里各位所说的成梭型或成纤维样细胞呢？8 B+ [- m2 y9 O. b/ M* o/ F
各位大大帮我看看！谢谢了！, j0 Y. K1 n6 J
第一张  P0  Day6  50×
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第二张  P0  Day6  100×5 Y8 R2 I' l7 [6 h7 Z# D
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第三张  P0  Day6  200×/ P- W% `# T3 t
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作者: huajie881026 时间: 2012-7-17 23:34

各位大侠，现在这细胞可以吗？1 A! S0 ^5 ]# H# u h6 ~
请教了！

作者: jiojoo 时间: 2012-7-17 23:36

提取失败
和我之前的一样，期待大侠出现

作者: daytoday 时间: 2012-7-18 01:27

不是MSC，像内皮细胞或者血液中的杂细胞的混合体: V. t1 I9 V6 S8 D% U; M
重新做吧

作者: dyg108 时间: 2012-7-18 08:57

全骨髓法？没看到集落？等，或重新开始

作者: 妖妖空 时间: 2012-7-18 09:18

重新开始吧，这样基本上已经失败了。或者你可以等等看。

作者: zmm 时间: 2012-7-18 09:20

回复 huajie881026 的帖子4 G/ x' t8 T6 t: w$ C4 F
6 J0 G6 e5 y& }8 H, D" U
采用什么方法提取的？全骨髓还是梯度离心方法？可以在培养看看，我觉得还可以，刚分离出来的MSC在形态上是比较丑的！

作者: huajie881026 时间: 2012-7-18 10:05

dyg108 发表于 2012-7-18 08:57
* K! B0 |4 v5 Q& \全骨髓法？没看到集落？等，或重新开始

( e9 P3 _* p1 B8 P% v0 f, U: {
嗯是全骨髓法，请问如果有MSC集落，一般多久会形成？

作者: huajie881026 时间: 2012-7-18 10:07

zmm 发表于 2012-7-18 09:20
. [8 L* H+ u" `9 ?5 O; J4 _回复 huajie881026 的帖子
5 y: ~: \2 p- M% n; U; R: s3 r- w1 S/ A7 H* m9 B; Q P% M' |
采用什么方法提取的？全骨髓还是梯度离心方法？可以在培养看看，我觉得还可以， ...

7 U# O4 c9 ?( u) h
是全骨髓法，上面各位大侠说失败了，为什么会失败呢？我严格按照操作流程来的，为什么会没有MSC集落呢？求教了

作者: zmm 时间: 2012-7-18 10:25

回复 huajie881026 的帖子

应该会有集落，因为你用全骨髓的话，杂细胞会很多，所以可能形成集落。那你的操做流程是？

作者: huajie881026 时间: 2012-7-18 10:44

zmm 发表于 2012-7-18 10:25
# h; x/ z8 P0 X6 t: X# S回复 huajie881026 的帖子
7 l( [" N2 m7 ]/ j0 O. Y* Z" ~ m, q6 v" m1 V3 K! @) L
应该会有集落，因为你用全骨髓的话，杂细胞会很多，所以可能形成集落。那你的操 ...

取健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（鼠龄6-8周，体重150-200g），颈椎脱臼处死，置于浓度为75%的酒精中完全浸泡5min。用无菌镊将大鼠放在无菌大培养皿中，放入超净工作台内，剪开大鼠皮肤和肌肉组织，取出股骨和胫骨，放入盛有含1%双抗液的PBS的培养皿中。将附着在骨头上的肌肉、筋膜等组织尽可能的去除干净。将股骨和胫骨转移到DMEM-LG培养基的培养皿中，用无菌镊夹起骨头，剪断胫骨和股骨两端。用2ml注射器吸取完全培养基（含10%胎牛血清的DMEM-LG培养基），迅速反复冲洗骨髓腔（冲洗液另用一无菌培养皿接住，骨头不与冲洗液接触），直至骨髓腔发白。用吸管将冲洗出来的细胞反复吹打混匀，200目滤网过滤除去大块杂质和组织，制成细胞悬液。将制成的细胞悬液用吸管移入无菌离心管内，配平离心机，1000rpm，4℃，离心5min。吸管小心吸弃上清液，加入适量完全培养基到离心管内，混匀重悬细胞,接种于T-25的塑料培养瓶中，置于37℃，5%CO2恒温孵箱中培养。48h后全量换液。小心吸弃上半层培养基，加入等量新完全培养基，继续培养。以后每3天全量换液一次。
目前就做到这一步，求教我哪一步出问题了呢？

作者: dyg108 时间: 2012-7-18 11:21

才5天，也不能说失败，过几天也有可能会形成集落，毕竟骨髓中MSC含量是非常少的。
按照你的操作方法有几点应该注意：
1、操作速度，从处死到得到细胞的时间越短越好；$ j1 L* g& S5 P/ d6 e
2、动作幅度，操作过程中动作幅度不能太大，尤其是冲骨髓的时候，用力过猛损伤会比较严重；) y+ r1 ]" z/ p* s) d9 \
3，可以省略过滤，骨髓中MSC本来就少，所以尽量减少再过程中的损失，过滤就可以省掉啦，因为传代和换液的过程中一些大块的组织自然会被丢掉

作者: franklinhg 时间: 2012-7-18 13:23

一只成年的SD大鼠的两后肢完全可以接种一个T75的瓶子了。不知你用的滤网是那种一次性的塑料的还是不锈钢的？一次性的塑料的滤网容易吸附了MSC，这个我有过失败的经验。多数MSC在塑料滤网上，没有下来。去年在喜欢喝咖啡的国内的所谓国际大都市参加的一个会议上，有人也报道了这个现象，并且好像是以此滤网为支架，诱导向软骨分化（时间有点长了，当时也没有注意听。。。）。希望有所帮助！

作者: huajie881026 时间: 2012-7-18 19:59

franklinhg 发表于 2012-7-18 13:23 / ?: [- L! S) a
一只成年的SD大鼠的两后肢完全可以接种一个T75的瓶子了。不知你用的滤网是那种一次性的塑料的还是不锈钢的 ...

4 x( b) @% g8 l. V8 z7 D' _6 |5 _
我用的是200目的不锈钢滤网啊，应该不会有很多细胞在这个滤网上吧，难道要将滤网再冲洗，把细胞冲下去？

作者: 星火燎原 时间: 2012-7-18 21:48

可以试试用ficoll分离一下先，再中瓶，一只中两个T25,三四天就能看到小的集落

作者: 飞翔的十字架 时间: 2012-7-18 23:00

我觉得7周龄的实在大了点，3-4周比较合适

作者: huajie881026 时间: 2012-7-18 23:01

dyg108 发表于 2012-7-18 11:21
7 u3 K+ s4 P) u t! p2 p: ~' J才5天，也不能说失败，过几天也有可能会形成集落，毕竟骨髓中MSC含量是非常少的。
0 y% P' b1 K0 `9 K+ j8 [2 I- a) }按照你的操作方法有几点 ...

8 p) b; h2 {- v- |9 k) l* V
嗯，如果再做，我会注意这些的，谢谢啦!

作者: huajie881026 时间: 2012-7-18 23:02

星火燎原发表于 2012-7-18 21:48 & z" x; b+ L) ^3 o
可以试试用ficoll分离一下先，再中瓶，一只中两个T25,三四天就能看到小的集落

1 P! R; l' t/ S" D: a
是说我现在的细胞再用ficoll分离一下吗？

作者: huajie881026 时间: 2012-7-18 23:06

飞翔的十字架发表于 2012-7-18 23:00 ' K( L5 o8 ~3 ?( I7 j; J0 W
我觉得7周龄的实在大了点，3-4周比较合适

7周龄大吗？我看文献多是6到8周啊，也有4到6周的，是因为周龄太大，所以MSC少然后不好养？

作者: 飞翔的十字架 时间: 2012-7-19 00:07

回复 huajie881026 的帖子5 T* S9 P) w& S" a

随着周龄变大，MSC在骨髓中的比例会下降，但是骨髓总的细胞数量会有一个增长然后到平台。文献确实有8周的，但我自己的经验，3-4周的比较好

作者: huajie881026 时间: 2012-7-19 00:36

飞翔的十字架发表于 2012-7-19 00:07
4 |, Z& ] {8 h, `' S9 o( X( `回复 huajie881026 的帖子
( s$ t6 k% _3 s% d% y( }% J7 S
随着周龄变大，MSC在骨髓中的比例会下降，但是骨髓总的细胞数量会有一个增长然后 ...

嗯，好，谢谢指点，我下次买4周的大鼠。。。

作者: cx4236850 时间: 2012-7-26 10:55

我的30月龄的老年大鼠MSCs都能出很好的辐射状集落，做不出来和年龄没多大关系，首先看你步骤，发现和我有很大的不同，我采取的是全骨培养法+percoll不连续密度梯度离心法，而且我的全骨培养法不是冲骨髓腔，因为成年大鼠或老年大鼠有大量髓液是存在干垢端的，你把干垢端剪了然后去冲骨腔，很明显很多髓液都被你事先给扔了，所以我采用的是破骨培养法，就是把剥好的骨头用骨剪咬碎，然后用培养基冲洗，最后将收集的髓液用percoll梯度离心，48H首次换液，5天可以传代，效果很好，大概三天就能看到MSC辐射状集落，5天可以达到传代水平（限于成年大鼠，老年需要9-10天），这是我做得老年大鼠的图片，就是用上面的方法，大概7天左右的，200倍下观察。

作者: cx4236850 时间: 2012-7-26 11:04

我觉得你最好不要用筛网过滤，这样很多细胞会被你滤掉的，有的时候有组织块残留的话会在组织块周围长得很好，不一定要除掉组织块，而且我没用过滤换液几次杂细胞明显减少，传代之后几乎没有杂细胞了。

作者: huajie881026 时间: 2012-7-26 11:10

cx4236850 发表于 2012-7-26 11:04
) ]& p) `' g7 t9 _; ^我觉得你最好不要用筛网过滤，这样很多细胞会被你滤掉的，有的时候有组织块残留的话会在组织块周围长得很好 ...

+ h: Q! ~8 p$ C! p* \! G
嗯，谢谢指点，我下次用你的方法试试。。。

作者: bnm789 时间: 2012-8-29 14:48

请问楼主这批细胞结局怎么样最近我的大鼠MSC跟这差不多你现在做的大鼠MSC是怎样提的？请不吝赐教

作者: huajie881026 时间: 2012-8-29 16:02

回复 bnm789 的帖子/ S* F6 y; ~& o7 u% e4 }2 B
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细胞基本都冻存了（以后作细胞治疗要用），仅有的都传着代，P5以后部分细胞老化了，现在P7老化的很厉害了！大鼠骨髓MSCs就是按一般操作提取的，没有什么特别的。请问你想知道哪部分操作？我全打出来太耗时了，网上复制黏贴一个给你也没什么意思。如有需要我会尽量帮忙！

作者: bnm789 时间: 2012-8-29 22:01

看了你第一次提原代的方法想问一下后来你还用滤网过滤吗，你剪去骨头两端剪掉得多不多，我是把干骺端软骨掰掉，还有是你冲骨髓的力度大不大？你认为需要注意什么谢了

作者: bnm789 时间: 2012-8-29 22:02

回复 huajie881026 的帖子
" P/ s1 s2 [: F5 g' E
看了你第一次提原代的方法想问一下后来你还用滤网过滤吗，你剪去骨头两端剪掉得多不多，我是把干骺端软骨掰掉，还有是你冲骨髓的力度大不大？你认为需要注意什么谢了

作者: huajie881026 时间: 2012-8-29 23:31

本帖最后由 huajie881026 于 2012-8-29 23:34 编辑 * D" _: h* J+ }2 ^7 _  K1 q

回复 bnm789 的帖子
( u  x9 R) t; l5 D9 n- f, t
后来就没做过啊，一直在做人的MSCs。
骨头两端剪掉的不多，煎多了会损失骨髓。冲骨髓力度不需要太大的，冲洗液一滴一滴往下掉最好，冲到骨髓腔发白就可以了，力度太大会使冲洗液从上端溢出再混着骨头外表面往下流，容易混入非骨髓液。8 N5 K$ f8 F" U9 ~  O9 C; E0 B
需要注意无菌、谨慎操作，切忌求快。同一实验室另一位做MSCs的，每次做的很粗，但结果就是污染或者没有细胞生长。大鼠MSCs还是很好分离的，我做了两次都成功了，只是原代传代的时间比文献和论坛里稍长，约12天左右传代，可能是我血清只加了10%，细胞长的不是特别快，想要快点长的话可以试试15%。% O7 T8 E& d2 l" Z
PS：最近有传代到P7的一瓶没有消化下来的细胞放着好久没去管它，长的形态也蛮奇怪的，呈岛屿样生长，估计不是MSCs，正查资料看是什么细胞。。。

作者: wangbiao915 时间: 2012-9-1 18:00

7周龄的SD会不会太大了啊我都用3周龄的SD，全骨髓培养的话一周就可以结束原代了

作者: 蔚海橙天 时间: 2012-9-5 11:44

建议重做，里面混了血细胞等杂细胞，有部分形态上像MSC，最好把你做的步骤说说

作者: caoshuaishuang 时间: 2012-9-7 20:12

以我的观点，原代一般做不出漂亮的梭形，你养2天，然后传代，P1、P2形状就标准了，只要严格按照操作流程来就成了

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