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标题: T载体克隆 [打印本页]

作者: bjshan 时间: 2012-7-18 14:12 标题: T载体克隆

现在正准备用T载体克隆一个基因，于是查了查有关T载体的文献。在“Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products”这篇仅有一页的文章中，作者写了一句话-“Vector self-ligation events are prohibited by the 3' thymidine overhang, and concatamerization of the insert is prohibited by the unphosphorylated 5' end, contributed by the oligonucleotide primer, as well as the 3' adenosine overhang added by Taq polymerase during the PCR reaction.”这里的Concatamerization是什么意思啊？引物使扩增的基因5‘端去磷酸化，但是这样的话，PCR产物如何与T载体连接啊？

作者: hndxws 时间: 2012-7-18 14:19

引物的拉出的pcr片段3‘端是有一个磷酸基团的吧，只是引物的5’端的磷酸修饰是可要可不要的，特殊实验需要标记时，往往在5‘端标记。所以总体上来说，虽然引物上没有磷酸基团，但是每个pcr片段的3’端都是有一个的，而克隆时有这一个就够了

作者: bjshan 时间: 2012-7-18 14:25

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为什么3’端有一个磷酸集团呢？不是-OH吗？

作者: akxiaoqiang 时间: 2012-7-18 17:46

回复 bjshan 的帖子2 t; u' z9 D3 [4 f# x8 E% I
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5端的磷酸化是由引物提供的，而3端的A是由Taq酶在PCR反应后的产物上加上去的。载体的5端应该是去磷酸化的，不然容易发生载体自连，大概是这样。建议楼主查看中文文献即可，因为T载体克隆较容易，国内已做得非常好了，英文文献就免啦

作者: bjshan 时间: 2012-7-18 18:19

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谢谢了。

作者: lugu167 时间: 2012-7-19 04:33

载体的5端应该是去磷酸化的，不然容易发生载体自连，大概是这样。不过一般PCR产物连接T载体，非常容易成功，多挑几个克隆，即使有空载也容易排除。

作者: hndxws 时间: 2012-7-20 10:34

回复 bjshan 的帖子/ N. O5 {% ~+ w1 x" h
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因为PCR时用的是dNTPs

作者: hndxws 时间: 2012-7-20 10:42

楼上的观点基本上是对的，但是有一点，3‘端的磷酸基团并不是通过加A才有的，即使不加A，3’端也是有磷酸基团的，加A只适用于T载体克隆，因为KOD是平末端的，所以要加A，但是加A之前PCR产物也是有磷酸基团的。我有用过天跟公司的载体，他们的不叫T载体，因为他们是平末端的，这种载体KOD-PCR后的产物，直接就可以去做克隆，不用加A。3‘端有磷酸基团我觉得就是我上面说的原因。个人看法，不认同我的话也不会影响你做实验的。

作者: hndxws 时间: 2012-7-20 10:44

PS：天根公司的这个载体，是zerobackground的。T载体不能保证百分之百是阳性克隆

作者: 不倒翁 时间: 2012-7-20 11:25

T载体有平端的也有带T的粘性末端的

作者: hndxws 时间: 2012-7-20 13:04

上面诸位同仁，首先我要说声道歉啊，其实我上面的回复只是自己的想法，我想了想，是说不通的。所以我赶快查了资料，又跟同学们确认，发现自己的确错了。现在我纠正自己的错误。/ @, }% X) q* k) @" X/ O, B: c
首先回答楼主的问题，同时纠正我的错误：T载体大多是通过EcoRV等平端酶切割，然后加T做成的，这个过程中，T载体是没有去磷这个过程的，所以T载体是有磷酸基团的，至于自连，T载体理论上是不会自连的，T载体自连最可能的原因是加T的反应不彻底。PCR产物是不带磷酸基团的，因为引物的5’端没有磷酸基团。我们平时用的克隆引物都是不带磷酸基团的，这个上面的回帖人akxiaoqiang 可以去确认一下，原因有两个：一个是制作工艺的原因，引物的5’端需要偶联在一个位置后才能合成，所以如果要把5‘端加磷的话，工艺就多一步，而且这一步又是多余的（如果你只是做克隆的话）；二是引物5‘端如果有磷酸基团的话，PCR片段本身会自连（这是楼主引的那句英文的意思）。然后连接酶作用的条件是5’端至少一个磷酸，和3‘端的-OH。所以PCR片段可以和T载体连接。, a: o: w1 R; v5 d# |" z& ~
taq酶的加A也并不能加磷酸基团，只是为了配合T载体的T粘性末端。我上面的帖子也是错的，因为PCR的3’端是没有磷酸基团的，只是-OH，这个楼主是对的，我错了。% h9 J: U, x+ e6 a; E
至于做单酶切的克隆，载体是要去鳞的，这样的话，就跟T载体不一样了（T载体是有磷的），但是要连进去的片段同时也是经过酶切的，所以它的5‘端是有磷，满足了连接的条件，可以做出克隆。( f( M, n' ~- q
不知道我的意思楼主听明白没有？对之前我的错误认识道歉，希望能纠正一下，改变像我一样错误的认识

作者: hndxws 时间: 2012-7-21 00:24

不好意思，我要向大家道个歉，我对上面帖子的回答是自己想当然的认识，我后来想了想，是说不通的，在这里向大家道个歉，回答了错误的答案。有一点其实楼主是正确的，PCR产物的3’端是-OH ,今下午，我又搜了相关的资料，加上和同事的讨论，纠正一下我之前的答案
首先我先回答楼主的问题，PCR产物是不带磷的，但是T载体是带磷的。公司的T载体的做法一般是用EcoRV等这样的平端酶切割后，再加上加T这个过程做出来的，之间没有任何去磷的步骤，所以T载体是5’端是带磷的。但是T载体本身理论上是不会自连的，因为末端都是T不匹配，自连的原因我觉得是因为加T不彻底造成的。PCR产物也是不带磷的，原因是引物的5‘端没有磷（楼主问的英文翻译），这个问题上面说有的那个同仁可以去核实一下。我们做克隆的引物5’端一般是没有磷。这主要有两个原因：一个是工艺上的问题，引物合成石时5‘端需要固定在一个地方才能合成，所以是没有磷的，如果要加磷，工艺上就会多一步，而且这一步对于分子克隆来说绝对是多余的，特殊要求的除外，如标记探针等；二是，引物如果5’端有磷，PCR的产物5‘端就会有磷，这样pcr产物就会自连（楼主问的英文翻译）。形成串联体。所以引物是没必要在5’端有磷的，pcr产物也是没有磷的，也不会是taq酶加A加上去的，这个楼上有个同仁也错了。# d% ^0 d4 C$ S( [' B
连接要满足的条件是5’端至少一个磷酸集团和3‘-OH，只要满足了条件才有可能连接成功。我们在做单酶切克隆时，跟T载体克隆也是不一样的，主要差别就是磷到底是谁提供的，因为单酶切克隆时，载体是要去磷的，这样载体就没有磷了，而T载体的磷是在载体上的。单酶切克隆的磷是有片段插入片段经过酶切后在插入片段的5‘段产生的。; h( v% d2 X- o9 b5 O: I- A; h
以上是我觉得正确的答案，我首先纠正一下自己的错误认识，同时也纠正一下上面那位我确定你的确错了的同仁。

作者: hndxws 时间: 2012-7-21 10:54

我连续写了两次帖子来纠正自己的和楼上一个同仁的帖子，都不见了。我也懒得写第三次了。我首先道个歉，我给楼主回答错了。楼主这点是正确的，pcr产物的3‘端是没有磷的。这个磷不是taq加A时加上的，也不是引物上带的，引物的5‘端对于普通克隆来说，都是没有磷修饰的，磷在T载体上的5’端，这个可以看看T载体的制作过程。连接酶作用的条件5’段至少有一个磷酸集团和3‘端的OH。6 d n4 D0 A% ^+ L+ [& ~% L* B
顺便翻译一下楼主问的英语：T载体理论上是不会自连的，因为末端都是T不匹配，自连的原因可能是加T时不彻底造成的。pcr产物也因为引物的5’端没有磷因而也不带磷，为了防止形成串联体，taq酶加A后可以与T载体连接

作者: hndxws 时间: 2012-7-21 11:01

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我连续写了两次帖子来纠正自己的和楼上一个同仁的帖子，都不见了。我也懒得写第三次了。我首先道个歉，我给楼主回答错了。楼主这点是正确的，pcr产物的3‘端是没有磷的。这个磷不是taq加A时加上的，也不是引物上带的，引物的5‘端对于普通克隆来说，都是没有磷修饰的，磷在T载体上的5’端，这个可以看看T载体的制作过程。连接酶作用的条件5’段至少有一个磷酸集团和3‘端的OH。0 C9 s6 ]0 [( j- }
顺便翻译一下楼主问的英语：T载体理论上是不会自连的，因为末端都是T不匹配，自连的原因可能是加T时不彻底造成的。pcr产物也因为引物的5’端没有磷因而也不带磷，为了防止形成串联体，taq酶加A后可以与T载体连接

作者: bjshan 时间: 2012-7-21 23:55

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首先，我对你对待问题的态度感到吃惊，能够如此费心解答别人的问题的人在生活中一定是个热爱思考、有责任心的人。现在，我对你的辛苦表示感谢。再者，我想再问一下，是不是5‘端没有磷酸的PCR片段，与T载体3’端连接时，因为两者都没有磷酸，会在这条链上留下一个缺口，导入到目的菌后，由菌的修复系统识别并修复呢？

作者: hndxws 时间: 2012-7-22 00:14

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是的，是这样的。两条链会有一条有个切口（切口和缺口不是同一个概念），而且是在细菌体内修复的。

作者: bjshan 时间: 2012-7-22 09:06

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留下一个切口，你说缺口和切口不一样，那么nick指的是是哪一个？

作者: hndxws 时间: 2012-7-22 10:22

缺口和空隙指缺碱基，相应英文为gap。2 v% q7 V/ ^$ p( S; O8 n
切口为缺磷酸二酯键，相应英文为nick

作者: bjshan 时间: 2012-7-22 10:26

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知道了，谢谢。

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