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标题: MEF原代第一次传代 [打印本页]

作者: wawj 时间: 2012-7-18 14:25 标题: MEF原代第一次传代

这次做的ＭＥＦ原代，状态很好，种了六个Ｔ７５大瓶，昨天是第三天，传代，冻了５管，传了一瓶，一传二。奇怪的是，今天看传的那两个大瓶液体变得很黄，飘得细胞较多，贴的也还可以。不会是污染吧，那冻得那几管是不是也不能用了。: Z' a+ g. C' y6 P; L
分析原因：
１，昨天传代时细胞量比较多，每个瓶子接种的细胞都比较多，会不会因为细胞比较多，增殖较快，液体一天内就变黄了。
２，昨天传代时上一瓶高糖ＤＭＥＭ刚好快用完了，所以用新配的高糖ＤＭＥＭ，不会是这个液体有污染吧，今天已吸了一点液体放到离心管里培养，明天继续观察。( v) s& S3 E x# m; J% _$ ^
３，以前还没出现过这种情况，今天看到液体很黄，怕是污染，不知道该扔不，就把两瓶细胞都传了，种了一个大瓶，其余细胞扔了，继续观察中，不知道这种处理对吗？请高手指教。
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作者: jiefengbing 时间: 2012-7-18 16:57

液体变黄太快可能是细胞数量有关，你仔细观察下你那飘得是细胞还是很密的细菌？一般来说MEF到第三代状态还应该不至于飘起来。

作者: akxiaoqiang 时间: 2012-7-18 17:48

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染不染菌镜下一下子就看出来啦

作者: wawj 时间: 2012-7-18 17:59

回复 jiefengbing 的帖子/ ^6 Z" I6 |0 t5 `: V

没污染过不知道感觉跟以前飘得细胞不一样细菌飘起来是啥样

作者: wawj 时间: 2012-7-18 18:00

回复 akxiaoqiang 的帖子; t( `, N0 d2 e9 e1 m

咋看呢，求赐教。以前没遇到过

作者: wawj 时间: 2012-7-18 18:05

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今天其实还仔细看了，不像是细菌，但因为没见过，也不清楚。还有一个小细节，今天传代时细胞很难消化下来，不知道有什么提示没，消化步骤都跟以前一样。

作者: chentian820 时间: 2012-7-19 09:43

与其找原因，还不如把培养基什么的过滤除菌，然后再做一只老鼠。节省时间。

作者: wawj 时间: 2012-7-19 12:28

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说的也对，就觉得这只老鼠白白牺牲了。刚冻的细胞能拿出来复苏吗，效果怎么样？想复苏一管，看那些冻得细胞是否也污染了。

作者: wawj 时间: 2012-7-19 12:32

回复 jiefengbing 的帖子9 w/ L9 a2 B. v. F% w

被您猜中了，昨天传代，今天一看，液体又变黄了，基本没贴壁的，飘得是很密的细菌，感觉还在动，是细菌吧，还是什么更恶心的污染。我把细胞扔了，昨天放到孵箱的离心管的液体没变黄，但也不能排除有污染，准备重新配液体。冻得细胞想复苏一管看看，如果也污染了，就要重新做老鼠了。又得重来一次，深恶痛绝的污染啊！

作者: 刘森泉 时间: 2012-7-19 13:04

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什么方法做的MEF，状态比较好。能分享一下吗？谢谢。

作者: wawj 时间: 2012-7-20 00:00

回复刘森泉的帖子
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我做的是昆明小鼠的孕鼠，孕13-14天。可能有些人是用ＣＦ－１小鼠，但方法都一样。下面是我的操作步骤，每次分的都挺好，分享一下。
１.颈椎脱臼处死孕鼠，立即放在预先准备好的７５％酒精里，浸泡大概五分钟。（一般就是从动物房拿到细胞室的时间，下一层楼。浸泡时间不能过长。）
２.以下过程在超净台里操作。将孕鼠放在一无菌培养皿中，腹部朝上，剪开腹部皮肤，剪一个小口，然后用手撕开，充分暴露术野。
3. 用棉球擦一下剪子，酒精灯烧一下，进行下面操作。剪开腹膜，提起子宫，剪断子宫系膜。将子宫放入另一培养皿，滴少许PBS（做原代时ＰＢＳ不需要预热，温度较低对分离细胞有好处）然后进行钝性分离。用两把镊子，将胚胎一个一个拿出来（去除了胎盘胎膜），放到另一培养皿，进行去头，去尾，去四肢，去内脏操作，余下的躯干部分放到另一培养皿，用剪刀充分剪碎后吸到10ml离心管里。6 u' G4 t1 x- r' ^( z) R# ?
4.用PBS洗一到两次，然后进行消化，10ml离心管大概加0.25%胰酶1ml,再用ＰＢＳ稀释３－４倍。震荡消化，时间最长不超过5分钟。一般我到3分钟的时候就剩一些絮状物了，基本没细胞了，就立即终止消化，用200目筛网过滤，收集滤液于离心管中，800r/min,5min,弃掉上清，用新鲜培养液重悬，接种到预先铺有明胶的T75瓶中（这样有助于贴壁）。一般两个胚胎种一大瓶。我一般一次能种六瓶。

作者: lchoxy 时间: 2012-7-20 00:28

看看这个protocol

作者: lxm5668 时间: 2012-7-20 08:06

你的PBS或者胰酶有污染的可能。怎么会好好的一下子连冻存的都污染了呢。! b$ U4 V# H: ^3 A e! h
养细胞建议要分批次做。传细胞时密度不要传的一样，有密有稀，这样下一次传代就能分开了，所以有问题时也不至于全军覆没。

作者: lxm5668 时间: 2012-7-20 08:08

盛夏季节特别容易细菌污染，防不胜防。细胞间彻底消毒一次，该休假休假，错过这段点背的阶段。

作者: wawj 时间: 2012-7-20 09:27

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恩，谢谢，冻存的的污没污染我还不确定，复苏了再看看，你这个建议不错，谢谢指导。

作者: wawj 时间: 2012-7-21 21:40

复苏了一管冻存的细胞，没有污染。谢天谢地，冒险用原来的培养液养的。证明培养液没有污染，ＰＢＳ，胰酶也都是好着的。至于它为什么污染了呢，现在看来可能是以下两个原因：$ ^1 y& `8 ]: j: [# R
１.当时瓶子没有完全烤干，还有点湿，污染会不会来自那里。. Q, s$ K) \- v W: D
２.为了节省明胶，用过一次的明胶回收，下次再用一次再弃掉。当时铺的明胶是回收的明胶，以前都好好的，这次就出问题了。看来以后不能明胶回收了。

作者: pjlsyz 时间: 2012-8-3 11:01

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我晕。。。你这东西解压不了。。。

作者: huangcong1988 时间: 2012-8-3 16:39

回复 wawj 的帖子7 w) ?4 x0 X- z
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跟你分MEF的方法很类似，但是我遇到的问题跟你不一样，我是冻存以后MEF状态就不行了，要么复苏不贴壁，贴壁的传两代就污染。这个问题遇到很多次了，分MEF的时候状态很好，而且我一般是一天不到就能完全贴壁，满瓶(T75).今天分，第二天早上就可以冻存了，但是冻存后复苏就怎么都不贴壁。之前我发帖里面有我细胞的图片http://www.stemcell8.cn/thread-58210-1-1.html

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