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标题: 大鼠骨髓源性EPCs分离和培养-有关分离的单个核细胞接种问题 [打印本页]

作者: jxmudby 时间: 2012-7-29 14:52 标题: 大鼠骨髓源性EPCs分离和培养-有关分离的单个核细胞接种问题

本人课题方向是EPCs用于心肌组织工程的研究，开始分离和培养骨髓来源的EPCs已经一个多月了，前后分离原代细胞4次了，可最近两次，老是出现一个令人头疼的问题。
分离和培养过程如下：2只150g左右的SD大鼠，取股骨和胫骨，PBS冲洗骨髓腔，得到细胞悬液后先1000rpm,5min 离心取沉淀细胞，然后PBS重悬,用Sigma的大鼠Ficoll分离液（密度：1.083）进一步分离细胞,骨髓细胞悬液与Ficoll比例1:1，再设定20°C，2000rpm,30分钟离心，离心后白膜层不是很满意，仍混有少量红细胞（可能离心机启动时温度没达到室温，就离心了）于是吸取细胞层时多吸了一点，然后PBS洗涤两次，1000rpm,10min，再用30mlEGM2-Mv培养基重悬（新买的EGM-2培养基混匀细胞因子和血清、双抗后分装，冻存于-20°C后），细胞计数为5.6*10^6/ml,分别接种到一个六孔板和10cm培养皿（一个培养皿预铺了sigma, FN)。
本来是准备4天后首次换液，可在2天之后发现很多圆形细胞贴壁良好，已经长满，但是在200倍下看，体积很小，似乎必接种的时候还要小（估计是细胞长满后接触抑制），同时还有不少米粒样一头大一头小的细胞两两连在一起（问过师兄说可能细胞的不对称分裂，还有说可能是某种细菌），400倍下才看到细胞核。另外，还出现大量漂浮的细胞团，淡黄的颜色，于是吸掉上悬液，换新鲜培养基。观察一天后，发现贴壁的细胞又长满了，但是没有形态和体积上的变化，漂浮细胞团再次出现，再次吸掉上悬液，然后用0.1%胰酶部分消化2-min，消化下来的细胞重新接种（1:4），未消化下来细胞换新培养基继续培养，后面上述情况再次出现，再消化，前后三次，到最后细胞可能由于频繁操作，污染，然后全凋亡了视野下都是碎片。整个过程中从发现细胞长满和大量细胞团飘起，一直到到第三次消化后，细胞仍然是开始的状态仍然是开始的那种形态和大小，原代细胞养不了几天。这个问题一直想不通，考虑是白膜层不明显，接种时混有很多杂细胞或者是接种密度太大，还是污染，还请战友们多指导，共同学习！稍后再把细胞照片附上，看看到底是什么情况！

作者: jxmudby 时间: 2012-7-29 15:13 标题: 骨髓源性EPCs分离和培养-单个核细胞分离后接种密度

附上我前面说的细胞图片,400倍镜下看的。怎么都没人跟帖啊，太冷清了，呵呵！

作者: 细胞海洋 时间: 2012-7-29 15:33

本帖最后由细胞海洋于 2012-7-29 15:35 编辑 4 b& O/ ~# X+ I% R

单个图片不要大于1000kb 否则上传失败另外今天是周末人少

作者: jxmudby 时间: 2012-7-29 15:39

刚通过批量上传显示是成功的，怎么没看到图片啊？这边比丁香园上传图片要麻烦一点嘛，

作者: jxmudby 时间: 2012-7-29 17:02

刚将图片格式改为BMP的了，重新上传细胞X400倍光镜图片。

作者: jxmudby 时间: 2012-7-29 20:27

[attach]44587[/attach]

作者: jxmudby 时间: 2012-7-29 20:34

没办法，还是将格式设置为GIF的，重新上传，不过不太清楚了。

作者: jxmudby 时间: 2012-7-29 21:15

不好意思，刚传的两张GIF格式太不清楚了,还是用JPEG格式的，调整大小了。

作者: evial 时间: 2012-7-29 21:26

后面的不看，我觉得你分离步骤有问题，哪里弄来的分离方法？

作者: evial 时间: 2012-7-29 21:27

400倍能看到细胞很清楚了，我怎么觉得图片像是细菌？没有正常细胞啊!你在养细菌么？导师或者师兄师姐看过没有啊？

作者: jxmudby 时间: 2012-7-30 08:27

evial,请教下，你觉得分离步骤有啥问题啊? 这些小细胞看似细菌，可在高倍的有绿光片的显微镜下看能看到细胞核的，要是污染，也不知道是啥东东，真是急死了！

作者: evial 时间: 2012-7-30 10:28

你网上找一篇老外分离血单核细胞文章看吧。国内实验都有点捣糨糊，我只看老外写的方法，何况他们的方法有时也有点乌龙。

作者: redmaple 时间: 2012-7-30 15:17

以前的帖子也有这种情况，是原胶虫污染，大家这么认为，本人也遇到过这种情况一次，太多的小黑点点，发现聚集到一起，还不停的转动，能影响细胞的增殖，多的话细胞死亡。遇到此情况，只能重新来了。

作者: 细胞海洋 时间: 2012-7-31 14:42

回复 jxmudby 的帖子

你回复谁就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容像我这样4 b4 v( \2 x: @) [" s; G# U
; i- _9 T& R% n
否则他会看不到

作者: evial 时间: 2012-7-31 18:22

少量的存活细胞还能让你看到吧，但大多数那么小的像是链球菌么

作者: jxmudby 时间: 2012-7-31 22:53

回复 redmaple 的帖子- V# J; F: h( e8 \1 \

前辈,原来也听说过原胶虫污染，但一直没亲眼看到过，不知道一般原胶虫污染有啥特点，例如传播途径，可能污染源，还有碰到这种情况用双抗还能处理挽救啊？

作者: 穿越地平线 时间: 2012-8-10 05:48

2只150g左右的SD大鼠，取股骨和胫骨，PBS冲洗骨髓腔，得到细胞悬液后先1000rpm,5min 离心取沉淀细胞，然后PBS重悬,用Sigma的大鼠Ficoll分离液（密度：1.083）进一步分离细胞,骨髓细胞悬液与Ficoll比例1:1，再设定20°C，2000rpm,30分钟离心，离心后白膜层不是很满意，仍混有少量红细胞（可能离心机启动时温度没达到室温，就离心了）于是吸取细胞层时多吸了一点，然后PBS洗涤两次，1000rpm,10min，再用30mlEGM2-Mv培养基重悬（新买的EGM-2培养基混匀细胞因子和血清、双抗后分装，冻存于-20°C后），细胞计数为5.6*10^6/ml,分别接种到一个六孔板和10cm培养皿（一个培养皿预铺了sigma, FN)。
本来是准备4天后首次换液，可在2天之后发现很多圆形细胞贴壁良好，已经长满，但是在200倍下看，体积很小，似乎必接种的时候还要小（估计是细胞长满后接触抑制），同时还有不少米粒样一头大一头小的细胞两两连在一起（问过师兄说可能细胞的不对称分裂，还有说可能是某种细菌），400倍下才看到细胞核。另外，还出现大量漂浮的细胞团，淡黄的颜色，于是吸掉上悬液，换新鲜培养基。观察一天后，发现贴壁的细胞又长满了，但是没有形态和体积上的变化，漂浮细胞团再次出现，再次吸掉上悬液，然后用0.1%胰酶部分消化2-min，消化下来的细胞重新接种（1:4），未消化下来细胞换新培养基继续培养，后面上述情况再次出现，再消化，前后三次，到最后细胞可能由于频繁操作，污染，然后全凋亡了视野下都是碎片。整个过程中从发现细胞长满和大量细胞团飘起，一直到到第三次消化后，细胞仍然是开始的状态仍然是开始的那种形态和大小，原代细胞养不了几天。
兄弟，有两点你不需要做-------PBS冲洗骨髓腔后，没有必要离心，直接加在大鼠淋巴细胞分离液上；另外EPC没有你说的那样长得如此快，即使骨髓培养，也至少一个礼拜长出来，第一二天看到集落是正常的。你这怎么没有看到细胞集落啊？

作者: 穿越地平线 时间: 2012-8-10 05:50

总感觉你的细胞污染了，还有为什么你拍出来的照片这么怪，怎么不清楚啊？看看我拍的照片

作者: 穿越地平线 时间: 2012-8-10 06:31

MOUSE BM EPC

作者: 穿越地平线 时间: 2012-12-6 22:25

兄弟，拍照拍的清楚一点，怎么黑黑的？另外我之前在另外一个帖子里说过这个问题白膜层不明显的原因，你只注意了一点：离心时的温度，还有两点非常关键，一是淋巴细胞分离液的温度也要到常温才可以，在你准备分原代前你就要把他从4°冰箱拿出来恢复至室温，另一点则是离心时参数的设置，25°C，2000rpm,25min，注意是SLOW-OFF，慢加速，离心机自然停转。实际上25min就会到35min才结束。尽量缩短操作时间，还有可以在pbs中加点FBS。上面你附的图片八九不离十是污染的图片。

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