干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 泪奔，细胞还没是没有长出来！！求前辈指点啊！！！ [打印本页]

作者: sunflower636 时间: 2012-7-30 09:18 标题: 泪奔，细胞还没是没有长出来！！求前辈指点啊！！！

在实验室折腾了两个月细胞还没有养出来，真是相当的郁闷。现把我的试验步骤列出来，望各位战友指点迷津。* d$ B1 t& T: J& `8 x6 Y7 G+ p
1.无菌瓶收集手术中的脂肪，一般在20ml左右，最多50ml,迅速拿回实验室（有时候由于各种原因会耽误几个小时，不知道这样会不会有影响？）
2.在超净台中用加双抗的PBS反复清洗脂肪，一般到液体清凉就不洗了。- q3 x/ c6 K" O8 F- K [6 I
3.剪碎。用组织剪剪碎脂肪，并剔掉一些大的结缔组织，剪到米粒状大小。$ h8 ]" B: E- r8 a( g: h
4.消化。加入等体积一型胶原酶，190转，37度恒温摇床消化1个小时左右，直到成糊状。; T% |4 g3 G& ~4 E
5.离心，1300转离心10分钟。2 m* }4 y3 \5 w' u6 F/ I! n4 X* l# t
6.裂解，轻轻倒掉离心后的上清（上层的油总会残留一些，不知道这里各位战友有没有好点的办法。）加入红细胞裂解液，室温10分钟。
7.离心，再离心1300转，10分钟。) r1 L7 W9 D" w' g5 p
8，加含10%胎牛血清的DMEM:F12，吹打，制成细胞悬液。$ w9 J1 m5 i2 i! K. p8 g
9.接种。将细胞悬液接种于用基质胶铺板的培养瓶。
, `0 i/ I0 N1 W7 ?+ m

以上就是我的试验步骤，但是做了很多次，不知道为什么都没有脂肪干细胞的生长。不知道问题在哪里，离心速度不对？还是试剂质量不行？我用的是GIBCO干粉配制的培养基，血清是HYCLONE的。胶原酶是sigma的，问题究竟是出在哪里呢？望各位战友指点啊。多谢了。

作者: Tim 时间: 2012-7-30 09:23

回复 sunflower636 的帖子
. M7 V) m7 A! c, k' f
离心的转速比较高！时间比较长

作者: sunflower636 时间: 2012-7-30 09:39

回复 Tim 的帖子) D! P" n2 K& {

那一般用多大速度离心合适呢？1000转？5分钟吗？但是这样我也试过，但是离心管底没有看到细胞沉淀啊。

作者: evial 时间: 2012-7-30 10:30

本帖最后由 evial 于 2012-7-30 10:31 编辑 , Z6 A9 I' Y6 O6 F( v' w" q
1 ~. a3 Y- s2 M+ W! q
你要190太快了，细胞都摇碎了，你当要细菌啊！

作者: loyal 时间: 2012-7-30 11:03

300g，3min

作者: evial 时间: 2012-7-30 11:40

本帖最后由 evial 于 2012-7-30 11:44 编辑
. Z' l6 E% @9 M7 x* Y
小于2000转对细胞都是安全的，不同离心机轴不一样转速就没有可比性，一般用G来统一，有时300g相当于1200-1300转。细胞小的话离心时间长一点最长的15分钟也没有问题，一般5分钟可以把细胞离心下来。所以你的离心参数没有问题。
你的第五步，加过什么东西然后离心么？

作者: sunflower636 时间: 2012-7-30 13:36

回复 evial 的帖子

没有，我看消化成糊状就直接用离心机离心了。有的说要加血清终止消化，但是我查文献其实血清终止不了胶原酶的消化作用就直接没有加，离心了。

作者: sunflower636 时间: 2012-7-30 13:38

回复 evial 的帖子* l% C1 I( D q
4 h# k( y2 X \- s$ f
是吗？那你们都用的是多少转呢？文献里这是正常范围啊。最高还200

作者: sunflower636 时间: 2012-7-30 13:39

回复 loyal 的帖子

3分钟？？？会有细胞沉淀下来吗？

作者: stemcellmeng 时间: 2012-7-30 15:10

这个一开始胶原酶消化的时候，其实放在37℃的恒温培养箱中，过个5分钟点到几次就可以，一般这样就可以把细胞消化下来，不需要摇成糊状。应该是你能看到脂肪细胞消化完之后仍然留在上层，但是在下层会有ADMSC的沉淀，这样就可以了。离心的话一般800g即可。还有，你的脂肪的来源部位也有关系，一般是腹部皮下脂肪或者抽脂手术的好一些~

作者: 小猪快跑 时间: 2012-7-30 15:12

你那GIBCO干粉配制的培养基是高糖的还是低糖的，看看你的配方里的成分，此条仅作你的参考！

作者: evial 时间: 2012-7-30 16:28

800g这么高！约算下来大概3000转啊，细胞可能会碎掉或损伤。' G! \# X3 F7 y7 t1 ]6 u6 i
成糊状怎么可能离心下来？你不加液体么？

作者: evial 时间: 2012-7-30 16:28

800g这么高！约算下来大概3000转啊，细胞可能会碎掉或损伤。% C: c4 _ C8 Y y f ~; G
成糊状怎么可能离心下来？你不加液体么？

作者: sunflower636 时间: 2012-7-30 23:30

回复 stemcellmeng 的帖子
) J# E7 f. i$ _* a4 s6 F& t
800g??那最后一般是把组织消化成什么样子？汤状？之前剪的时候是完全剪碎吗？1mm的样子吗？如果没有剪这么碎会不会影响？

作者: sunflower636 时间: 2012-7-30 23:33

回复 evial 的帖子

哦，可能是我形容的不当，应该是消化成汤状，就是已经看不到一粒一粒的脂肪组织那种了。其中的结缔组织完全被消化下来了，所以离心的时候它们搅在一起，我都是在离心后用吸管把它吸出来，然后倒掉上清。

作者: cuiyongcuhk 时间: 2012-7-31 00:09

我觉得楼上有些道理，楼主再试试。

作者: stemcellmeng 时间: 2012-8-1 11:46

回复 sunflower636 的帖子

不是汤状，是剪得碎一些比较好，能剪多碎剪多碎，但是不要剪得时间太长，否则在外面时间太长细胞损伤太大，如果实在剪不到那么碎也可以，反正总会消化下一点细胞来。消化完以后，白色的脂肪会漂浮在上层，下面的液体由于细胞在里面会略显浑浊，还有一些组织小块如果MSC含量高的话就会沉在管子底部，一般颠倒一下对着光还能看出沉降的细胞。如果你觉得800高了可以降一下，用600g，10min试试。

作者: zmm 时间: 2012-8-1 11:59

回复 sunflower636 的帖子: o9 F& l! h. ^6 f* ~- r! I1 B

1.你消化时间太长了。大概在30min左右就可以了吧。' [+ n& V( k3 n/ l
2.消化时要加一些DNA酶，防止消化出DNA粘连一些细胞。! a1 J" C! _2 j; g% M9 O; ?3 e L
3.培养基体系不太好，这应该是非常关键因素。
4.没有终止消化。

作者: sunflower636 时间: 2012-8-2 09:52

回复 zmm 的帖子7 d! k8 Q* r7 ^6 H" j* J, U

嗯，我已参照各位的意见做了些调整，期待我的好消息吧！到时候传图上来。

作者: sunflower636 时间: 2012-8-2 09:53

回复 stemcellmeng 的帖子

嗯，貌似结缔组织也被离下来了，所以瓶底一堆东西。不过我最后制成悬液的时候用筛网过滤了。

作者: lingminliang 时间: 2012-8-2 10:27

我们一直做的是小鼠的你这个做的是人的ADSC吧反正我们做得小鼠的是我们胶原酶消化30分钟放在37°水浴锅，5分钟摇一次就行了，1000转10分钟。消化的时候加了一些DNA酶，防止粘稠，没有加红细胞裂解液这一步

作者: wiling123 时间: 2012-8-2 13:20

回复 lingminliang 的帖子: }4 ~& _( k* v6 |, M$ d, N7 H# }, G

你好，我最近也在做小鼠的，可是养的细胞不好，传代之后老化严重。请问你有这个问题吗？

作者: sunflower636 时间: 2012-8-2 22:23

回复 lingminliang 的帖子1 R. l# S% g' p
0 J3 k. G& ?3 s+ s
一些酶？具体的量是多少呢？

作者: 相宜 时间: 2012-8-3 17:59

我说说我自己的经验：第一个离心为800r，第二个离心为1000r，最后还有个100目滤网过滤的过程

作者: 相宜 时间: 2012-8-3 18:01

另外，培养基你配的是那种的，保险起见你直接买一瓶进口的，50块钱。你那么贵的进口材料都用了

作者: lingminliang 时间: 2012-8-3 20:27

回复 sunflower636 的帖子/ ~7 D/ k v1 M% d) u, F

200ug/ml 的200ul

作者: lingminliang 时间: 2012-8-3 20:29

回复 wiling123 的帖子8 A% H2 f; H, x2 U
5 _1 W* M0 f3 S4 h$ @
这个也有，而且第一次传代的时候很难消化下来有好方法吗

作者: yangwy028 时间: 2012-8-3 21:24

每次用酶，用裂解液都不提起终止的事。当然细胞就没法好好存活了，你倒是在每一步操作过程中取样看一下细胞形态和活率不就知道问题出在哪里了吗？

作者: sunflower636 时间: 2012-8-3 22:23

回复 yangwy028 的帖子
, W8 t8 d6 e) {& `4 C# L
胶原酶用血清中止不了，裂解过后是应该用PBS清洗一下。根据各位的指点，上周做了一次，终于看到细胞啦，但是数量超级少。

作者: sunflower636 时间: 2012-8-3 22:25

回复相宜的帖子3 C+ Z2 i+ D4 B4 p/ x3 n

培养基买的是GIBCO干粉配的DMEM:F12。后来买了HYCLONE的，准备下周用。上周又做了一次，终于看到细胞了，但是数量特别少。貌似长的也不快。第4天才看到梭形贴壁细胞，然后增殖的也慢。

作者: 相宜 时间: 2012-8-3 23:40

回复 sunflower636 的帖子7 n c1 h6 [# G2 O2 E
. J! L& n) Y( w7 b' J" h# v
一般48小时之后就开始看到了，到了第三天的时候就基本全部梭形了，4天的时间是不是稍微有点久了？

作者: sunflower636 时间: 2012-8-4 00:35

回复相宜的帖子
: F0 h' {4 G: p; r* ?! ?
但我真的是第4天看到的啊，数量很少，稀稀拉拉的。没有计数，因为当时操作的时候不小心浪费掉了一半细胞悬液，所以直接分瓶接种了。

作者: wiling123 时间: 2012-8-4 12:17

回复 lingminliang 的帖子
A/ X1 P( u# F: k* k& G8 d$ }
消化倒是好消化，一般30秒就够了，我还觉得是消化过猛导致的呢。你用的塑料培养瓶还是玻璃的？

作者: 相宜 时间: 2012-8-7 00:11

回复 wiling123 的帖子
: @1 B- M1 d( k) b0 p$ y+ W
我消化的时候是一直在镜下观察着，隔30秒就机械的拍打，直到全部脱壁为止，最长的一次消化了6分钟，但是觉得影响不大。当然，只是个人的一些做法。

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)