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标题: PBMC提取已经摸索好了，准备摸索CIK，麻烦懂的人进来看一下，万分感谢。。。。。.。。 [打印本页]

作者: 113305060 时间: 2012-8-8 11:06 标题: PBMC提取已经摸索好了，准备摸索CIK，麻烦懂的人进来看一下，万分感谢。。。。。.。。

前段时间一直在摸索PBMC，基本上已经摸索好了，现在准备开始做CIK了，但仍有几个问题不明，请知道的朋友解答一下，万分感激，呵呵！
1.PBMC提取完之后，我准备放到直径为100mm的细胞培养皿中培养，问题是PBMC的量是多少，我在文献中看到的是1x10 6/ml，那一开始加10ML培养基的话，那就要1x10 7的细胞，是否比较多了？？？! v8 a+ R+ W  @( M4 t, K; A
2.培养CIK一般利用什么培养工具培养？如果我一开始用直径为100mm的细胞培养皿，养到多少天后换成培养瓶（还是培养袋？），用什么规格的培养瓶或者培养袋？？？换液和传代的时候是否要离心？# X0 U  D( H( ?" X: c. ]
3.我采用的方法是于当天加入rh IFN-r 1000U/ml（请问是提取完PBMC立马加入，还是PBMC培养了2H吸取上清后加入），放置5%CO2、37oC孵箱中培养24h后，加入CD3 mAb 50ng/ml、及rhIL-2 1000U/ml继续培养，每3d换液并补充rh IL-2，培养至第14、15天，终细胞数为2x10 9-3x10 9。不知道这种方法是否可行，还是现在还有什么更好的方法，望赐教。( ]* X  t3 G3 f$ P& s$ i6 g6 [
4.CIK培养完成后，一般是用什么方法检测，看的比较多的是流式细胞检测CD3，CD4，CD8，CD56，这种检测方法是否能够说明问题？？？7 ~7 n& e" D( o: ?
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问题比较多，问的也比较乱，望大神能针对我的问题解答一下，谢谢！我的QQ是113305060。

作者: 花饶然 时间: 2012-8-8 11:28

1..你用的这个密度是比较普遍的，没有什么问题，只是我不大明白为何用培养皿来养，开始就可以用培养瓶，我觉得。5 v" A9 |9 W$ f" `3 X" A7 B2 M
2.用多大的培养瓶取决于你养的体系有多大，T75和T175都可以的。培养袋也有不同规格的供应。
3.如果你不养DC细胞，大可以在PBMC提取完就可以加IFN的，不用等待2小时。你所说的这种方法很通用的，有的人可能还会加下白介1。如果你最终得到如上的培养量是由1乘10的7次方扩增来的，我觉得量还是可以的了。
5.关于流式鉴定，很多人把CD3CD56双阳性细胞的比例作为一个标准。但是也有人会有其他看法，认为不一定如此。
以上仅供参考

作者: meixue1130 时间: 2012-8-8 13:02

我的回答和楼上的差不多
1.如果只做CIK培养的话，直接用培养瓶就可以了，一般有人分离PBMC后放在培养皿里，是为了分离贴壁细胞做培养DC用。如不做DC就可约去这步。
2.如果做预实验可用小规格的培养瓶，T25、T75都行，细胞多了就可以丢弃一些。若是用于临床的话就最好用大的培养瓶或者培养袋了，这样操作起来更方便，也节约耗材成本，若用小培养瓶，需要的瓶子太多，增加工作量。9 S: A. q f( L
3.因子浓度可以，加入的顺序也对。如只做CIK就直接分离完PBMC就可以加IFN-r了，若是也要做DC，就需要贴壁两小时，贴壁细胞作诱导DC用，悬浮细胞作诱导CIK细胞用。
4，流式检测主要就是你说的那几个。

作者: 113305060 时间: 2012-8-8 14:04

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非常感谢您的解答，我还有一个细节方面的问题，就是我如果放在T75（250ML)培养瓶中培养，先按照细胞浓度加培养基，比如说我先加了10ML，然后3天后，细胞浓度增加了，我是直接在里面加培养基，还是需要把细胞离心后再换培养基呢？同样如果细胞浓度增加到需要传代（需要多个瓶子养）的时候，是直接将原来培养液分为多份移到新培养瓶中，还是需要离心后，用新培养液分至培养瓶啊; g0 V5 ^3 j# z7 m0 w- X0 d

还有一个关于试剂的问题，培养基中加的CD3单抗是不是就是用来流式检测的CD3一抗，两者是一个东西吧

作者: 113305060 时间: 2012-8-8 14:04

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非常感谢您的解答，我还有一个细节方面的问题，就是我如果放在T75（250ML)培养瓶中培养，先按照细胞浓度加培养基，比如说我先加了10ML，然后3天后，细胞浓度增加了，我是直接在里面加培养基，还是需要把细胞离心后再换培养基呢？同样如果细胞浓度增加到需要传代（需要多个瓶子养）的时候，是直接将原来培养液分为多份移到新培养瓶中，还是需要离心后，用新培养液分至培养瓶啊

还有一个关于试剂的问题，培养基中加的CD3单抗是不是就是用来流式检测的CD3一抗，两者是一个东西吧

作者: 113305060 时间: 2012-8-8 14:14

再追加一个问题，就是如果从第一天（提出PBMC后加RH IFN-r）开始算，大概多少天能够诱导为CIK（能够通过流式检测出CIK）？？？？？？是不是随着培养时间的深入，CIK会越来越多，CIK本身会增殖吗？还是什么情况？？？？？？一般需要多少天能将原来1*10 7细胞量的PBMC诱导为终细胞数为2x10 9-3x10 9 CIK？？？？？？谢谢！

作者: woosheng 时间: 2012-8-8 15:45

回复 113305060 的帖子8 }9 J6 ~2 m; F; P5 s7 R7 r8 K
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[ 还有一个关于试剂的问题，培养基中加的CD3单抗是不是就是用来流式检测的CD3一抗，两者是一个东西吧]5 V; G( ? S# v
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不是。培养用的抗体和流式检测的抗体不一样。

作者: 113305060 时间: 2012-8-8 16:15

回复 woosheng 的帖子7 F# N3 x1 T* N/ F
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我在网上查到的细胞培养用的CD3 mAb 是PROSPEC的，具体说明是http://www.prospecbio.com/CD3_Human_Antibody_12_99/
不知道能不能用？你们用的CD3 mAb是什么品牌和规格的，能告知吗？谢谢

作者: 莫邪小仙 时间: 2012-8-9 16:51

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这个看细胞生长情况了，有的是直接加入新的培养基有的是半量换液，目的就是保证细胞的密度始终一致，我们采用的是半量换液。刚开始是离心了之后又换液的，但是后来发现离心不仅会损失细胞而且会破坏细胞，所以我们就没有离心了，直接换液。

作者: 113305060 时间: 2012-8-9 16:58

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谢谢您的回复

作者: meixue1130 时间: 2012-8-9 19:40

回复 113305060 的帖子1 P0 q3 H; f% _. x, l
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直接添液就行，不用离心

作者: liutianhua 时间: 2012-8-15 10:10

回复 113305060 的帖子
7 C7 T+ D# a) H3 ]
如果你第一天是这么算的话那养成CIK在15-22天吧。CIK培养就是你就随着细胞增长随着添液就是，还有你是打算用的什么培养基？是做临床还是做研究？

作者: 113305060 时间: 2012-8-16 09:16

回复 liutianhua 的帖子- I2 n) l; H8 U5 R& L* I
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打算用1640培养基+10%FBS+0.5%双抗。打算先做研究，后做临床。临床是不是要用到无血清培养基，什么无血清培养基比较好？谢谢

作者: liutianhua 时间: 2012-8-16 12:50

回复 113305060 的帖子+ Y, @3 B k! r9 s; U( E! K

临床是要用无血清培养基的，因为临床采血一般在50ml左右，离心下来自体血浆只有20-30ml，而临床上异体血浆是不允许的。
我是用自己研制的，具体情况在给你的另一个回复里说了。" i( _, ]4 i, W) R* m# o' Z, m
PS：临床的安全性没有问题，有医院检验科的第三方检验报告。

作者: 113305060 时间: 2012-8-16 13:48

回复 liutianhua 的帖子
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我们采用的方法是采用淋巴细胞分离液分离抗凝全血，取白膜层，也就是提取PBMC。您提到的全血离心血浆，不知道是什么方法，能否详述一下，谢谢

作者: liutianhua 时间: 2012-8-16 13:52

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就是采完全血先不稀释，直接离心，上层就是血浆，下层是血细胞，然后把血浆吸出来，然后再稀释血细胞，密度梯度离心，大体是一样的，就是多一步离心。

作者: 113305060 时间: 2012-8-17 14:11

回复 liutianhua 的帖子

我也看过类似文献，但他们是先离心一次，把血浆和红细胞层间的白色层吸出来，然后再稀释密度离心。请问你们把血浆层也吸出来是什么原理，血浆层不是没有细胞吗，谢谢

作者: liutianhua 时间: 2012-8-17 14:26

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血浆是为了培养细胞的时候用，这是自体血浆，这样在临床上才不会有问题。当然，用之前要灭活

作者: 113305060 时间: 2012-8-21 08:55

回复 liutianhua 的帖子/ s6 o, u8 E0 K7 n _
: s. {3 E; k0 A( [8 M
谢谢您的答复，我再想问一下你们血拿回来之后先离心一遍，将血浆和血细胞离心，然后再将血细胞稀释淋巴液再离心，再离心前血细胞是取血浆和红细胞中间的白细胞层，还是取除了血浆外的所有细胞层（包括红细胞）？谢谢

作者: liutianhua 时间: 2012-8-21 18:15

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分出来血浆之后在稀释血细胞，在进行密度梯度离心那步。

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