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标题: 求助TA克隆 [打印本页]

作者: chenjiahuan 时间: 2012-8-16 11:10 标题: 求助TA克隆

有谁用过Promega的PGEM-T-Easy载体，货号：A1360？为什么我直接用载体1ul,6 h* K O2 I8 k- J
去做转化和蓝白斑筛选，平板里既可以看到蓝斑也可以看到白斑克隆？另外我PCR产物265bp大小，做TA克隆，提质粒酶切鉴定后，一直连接不进去？但是以500bp大小的质粒连接，就很容易能够挑选到克隆！为什么呢？说明一点：500bp质粒是promega-T 载体提供的；PCR是用mix做的，mix中是否为Taq酶不知道？同时做了对照，在mix中额外加入了1ul维格拉斯的Taq酶。效果不额外添加酶，PCR条带清晰，额外加酶的条带有点儿模糊，同时做了，PCR产物直接连接，PCR产物乙醇沉淀后连接，转化均能长克隆，挑选后酶切鉴定不对？接下来我该怎么做？1 B3 I3 C0 ?6 O( n
说明：该PCR试剂盒DNTP，酶，引物都在一起，一个反应体系25ul， 50次的盒子，卖家6000多，我想知道引物序列，但是该盒子，引物该为简并引物，PCR条带大小为265bp-271bp。请各位大侠给点儿指点！

作者: 风雪叶杰 时间: 2012-8-17 20:06

怎么做的鉴定,酶切？建议直接使用引物PCR，如果有结果直接测序。200多bp酶切很多是很模糊甚至看不到的

作者: 风雪叶杰 时间: 2012-8-17 20:09

很久没用过T载体了，也不知道能不能酶切，我很久之前好像用的是PEGM-T这个载体，效果还挺好的，都不做蓝白斑筛选，直接挑选了做PCR鉴定，阳性率还挺高的

作者: frankieisme 时间: 2012-8-22 23:44

你还是找厂家的客服吧,直接转也能有蓝/白斑,说明试剂盒本身就有问题.建议: PCR的时候,在引物上加上酶切位点,直接酶切,连接到你的目的质粒中也是不粗噢的选择.

作者: linda9958 时间: 2012-8-23 23:51

pcr 产物中含有mix，里面有各种成分可能会干扰连接酶的，另外你用乙沉淀pcr产物，残留的乙醇对连接酶也是有影响的。可以尝试一下用回收试剂盒直接回收pcr产物，增加回收量也可以浓缩你的目的基因，希望对你的实验有帮助。

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