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标题: 有养过RAW264.7的高手吗？ [打印本页]

作者: 一转身的距离 时间: 2012-8-20 11:24 标题: 有养过RAW264.7的高手吗？

如题，请教，为什么细胞冻存后复苏不贴壁？是不是RAW264.7对胰酶的作用很敏感？但是为什么在培养时又会觉得很难消化？. Q$ i* R, \- p( k$ z, E
才养这株细胞，急求解答！

作者: crystal_xjw 时间: 2012-8-20 16:21

我也没养过，但是对这个问题好奇。复苏后不贴壁？难道细胞的性质有了变化？还是您在消化的时候酶太多了，细胞损伤了，已经死了，或许是这样。

作者: myboluo 时间: 2012-8-20 22:34

本帖最后由 myboluo 于 2012-8-20 22:40 编辑 , J( h, u0 |* G0 ?% O

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如果是传代消化时不贴壁应该是你消化时间过久导致细胞损伤了，可要是复苏时不贴壁可能原因就多了，降温过快、复苏操作不正确都可能导致细胞大量死亡（看看不贴壁的细胞是否边界清晰、透明，否则是死细胞）。RAW264.7本身贴壁非常牢，可我同学养了一段时间后，也比较好消化了。她消化时先用胰酶消化不超过5min，含血清培养基终止消化，之后用刮刀刮。后来嫌刮刀会污染，就用手拍打培养瓶代替（拍有细胞的那一面），或者尽量用吸管吹，吹不下来的就舍弃不要。消化下来后还不贴壁，请耐心等待3~5天（实际上就是放孵箱不管了，千万不要时不时的看），小鼠巨噬细胞贴壁都很慢，原代培养时需要7天左右。

作者: jimxia2011 时间: 2012-8-21 02:49

RAW264.7不适合用胰酶消化，，建议你用预冷的PBS侵泡5-10分钟，然后用移液枪把细胞打下来。。这个细胞容易老化，，不要每次多冻存点，，不要传太多代

作者: 一转身的距离 时间: 2012-8-21 10:21

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我们做了原代培养，2个小时后细胞就贴壁了，只是增殖就很慢了，贴壁后基本就不增殖了。这个问题我也一直很困惑~

作者: 一转身的距离 时间: 2012-8-21 10:23

回复 crystal_xjw 的帖子- U$ r( J1 [4 z9 F; z
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看样子这个细胞在消化时胰酶的用量和消化的时间还有吹打的力度都很有讲究。

作者: 一转身的距离 时间: 2012-8-21 10:25

本帖最后由一转身的距离于 2012-8-21 10:27 编辑

回复 myboluo 的帖子& i$ d" q+ r+ z; E
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不知道是不是冻存前培养时间太短的原因，因为冻存前细胞状态很好。最开始我们也是复苏培养的，2天后就可以传代了，1比3传代后，第二天就能冻存了。不知道是不是传代和冻存之间的间隔时间太短？冻存前消化时我们的消化时间确实比较长，超过了10min。

作者: 一转身的距离 时间: 2012-8-21 10:28

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没有试过用预冷PBS浸泡，因为它贴壁牢，所以没想过可以用这种方法。可以试一下。

作者: shy8610 时间: 2012-8-21 10:57

raw264.7相对来说，还是比较容易复苏的，要求是冻存株当时是健康优秀的，复苏的时候，尽量选用进口一次性耗材，包括管子和移液管，培养基单独配，不与其他细胞混用，PBS的要求一样，我们实验室十分介意raw细胞是否受刺激，消化情况也可以看出细胞的状态，一般来说，37度消化2分半，就可以镜下看出细胞变圆，然后可以用拍打的方式将细胞拍下，绝对比等着胰酶效果好，另外注意防污染黑胶虫

作者: 一转身的距离 时间: 2012-8-22 08:25

谢谢各位的建议与宝贵经验，很受启发！非常感谢！

作者: andyz0922 时间: 2012-8-22 08:54

我们的实验室都是用PBS 吹打的没有用胰酶消化的 RAW 很容易脱壁

作者: katysong 时间: 2012-8-22 11:26

回复 myboluo 的帖子$ Q. o* O. s3 s9 q. `$ m$ V

不知道你养的小鼠巨噬细胞是来源于哪里？骨髓还是腹腔？但两种巨噬细胞贴壁的话都不用太久，2小时后就开始贴壁了，当然我们一般是用过夜后再用的，不过确实增殖比较慢，除非加因子比如：M-CSF

作者: katysong 时间: 2012-8-22 11:32

回复一转身的距离的帖子
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我们一般是用加EDTA的胰酶消化的，加酶之前用预热的PBS多洗几遍，至少两遍吧，然后加酶消化，一般3分钟以后细胞就可以变圆了（当然也要看你酶的活性，刚开启或融化的胰酶效力会好一些），可以再等一分钟，不要直接把细胞吹掉或拍掉，可以先吸掉胰酶后用PBS洗一遍，防止EDTA对细胞以后的贴壁有影响，1：2或1：3传代都可以，看你原来的细胞密度；/ P" D. n j; u: t
复苏的话就只要注意快速融化，以防冰晶对细胞的影响，说难养其实还是挺好养的，要有信心，祝好运！

作者: eley 时间: 2012-8-22 11:48

强烈建议不要用胰酶消化，Raw对胰酶非常敏感，而且很容易分化。
还有就是在用之前的培养基一定要预热。. A% E0 U, o% s9 C* _) s# V1 e
我使用的是1640，现在细胞长得很快; c2 `0 o, P ?3 e) w
每次传代的时候，用枪把细胞吹下来就好，不要消化。

作者: myboluo 时间: 2012-8-22 21:28

回复 katysong 的帖子9 s) E6 P. A% u0 h
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我们也是两个小时贴壁，不过这时候还贴不牢，一吹一晃就掉了，要想贴的牢就需要7天左右

作者: 一转身的距离 时间: 2012-8-23 14:45

本帖最后由一转身的距离于 2012-8-23 14:46 编辑 . V% f3 B* B- d% P% \* M
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回复 katysong 的帖子' I" _6 A- o$ p8 }2 O$ U# a" B

我们原代培养的是腹腔来源的~

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