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标题: 大家都是怎么消化mES的 [打印本页]

作者: 不倒翁 时间: 2012-8-20 16:26 标题: 大家都是怎么消化mES的

最近养mES R1，看了很多protocol，都强调传代的时候一定要制备成单细胞悬液，要不然很容易分化。我消化的时候0.05%的胰酶消化3min，一拍盘细胞全都掉下来了，然后加2倍体积的培养基终止，发现细胞吹不散，种下去还是成块的。有没有有经验的人指点一下，消化多长时间，加多少体积的培养基重悬，吹散的时候大概吹打多少下？先行谢过了~

作者: sciencesky1 时间: 2012-8-20 16:38

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你是把ES养在MEF上吗，还是直接用培养基加Lif养的？我在养TS，细胞也吹不散，跟楼主一样，期望有高手解答！

作者: igdb 时间: 2012-8-20 16:40

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放在37度里再消化一会，大约3-5分钟。。不过我都是用0.25的胰酶

作者: 不倒翁 时间: 2012-8-20 16:49

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我养在feeder上的

作者: 不倒翁 时间: 2012-8-20 16:50

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培养基是加lif的

作者: 不倒翁 时间: 2012-8-20 16:51

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就是在37°消化的那我换胰酶试试

作者: iseeyou1210 时间: 2012-8-20 19:28

0.25% 的trypsin，消化5min，然后1100rpm centrifuge， 3min，去上清，加入适量的ES medium，吹打5次左右，一般都能形成单细胞。

作者: 生旦净末丑 时间: 2012-8-21 09:24

有可能是你的胰酶效果不好了，我们之前也出现过这种情况，消化几分钟后细胞能全吹下来，但是不能吹散成单个细胞，后来使用新鲜的胰酶消化两分钟吹两下就好了，你可以试一下

作者: BNJN 时间: 2012-8-21 10:14

可能是胰酶问题，我实验室也有放久的胰酶消化力下降的问题。可以把一瓶分装，不用的放-20，每次取一瓶出来，用前要混匀。

作者: 不倒翁 时间: 2012-8-21 17:33

回复生旦净末丑的帖子" |% t; G1 y# S8 O, ~" G
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那我换胰酶试一下你们用多大浓度的胰酶消化几分钟

作者: 不倒翁 时间: 2012-8-21 17:34

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嗯谢谢提醒我先换新的试一下

作者: BNJN 时间: 2012-8-22 09:24

我用的是0.5%的，同时含有EDTA

作者: 不倒翁 时间: 2012-8-22 15:51

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0.05还是0.5哦4 v5 A! x# u; X/ g. s9 x

作者: lchoxy 时间: 2012-8-23 10:37

我也遇到这种情况，有几个原因吧，一是FEEDER状态不好，或者增殖很旺盛，消化的时候就容易把细胞成片消化下来，而且很不好吹散。另外就是酶，还有消化时间- n* `& K5 F( ^% M2 D) F

作者: BNJN 时间: 2012-8-23 13:23

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0.05%,打错了

作者: 不倒翁 时间: 2012-8-23 15:33

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嘿嘿谢谢

作者: iseeyou1210 时间: 2013-1-18 15:55

不要忘记在胰酶里面加EDTA哦！

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