干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 问题请教我做的是小鼠胚胎干细胞的免疫荧光，想看加药后是否还能表达OCT-4 [打印本页]

---

作者: 李夏    时间: 2012-8-20 21:00     标题: 问题请教我做的是小鼠胚胎干细胞的免疫荧光，想看加药后是否还能表达OCT-4

3 O4 t" X* Z! p$ V  R
& s3 q( U) U/ t) ?7 a- N4 s
我做的是小鼠胚胎干细胞的免疫荧光，想看加药后是否还能表达OCT-4，SSEA即是否还有自我更新能力，但是效果一直不好，主要问题细胞经过多次冲洗到最后观察时已经掉下来了，由于我的药物是DMSO配置的不能紫外消毒，所以有时经过四天孵育后，细胞就染菌了。。。。有没有人能指点一下啊    感激不尽啊

---

作者: fish_zbw1985    时间: 2012-8-20 23:35

回复 李夏 的帖子. d1 l) S3 I8 W7 U6 m& y

. t/ n2 m: r8 x回答你的两个问题:
; ~3 N; D9 b% j1.细胞作免疫荧光掉下来多半可能是你没有把细胞用多聚甲醛完全固定住造成的
- {- _, ~& W% B& H( Z4 T" D2.DMSO毒性较大溶解小分子化合物污染概率非常低,配置完成后也没有必要也没有办法过滤.

---

作者: jhu132llh    时间: 2012-8-21 08:29

1.DMSO也是可以过滤除菌的
" q, w' @" o1 h3 x: d使用特殊的抗有机溶剂的滤器5 j9 \7 \, R4 @! W/ h2 z$ L
很多公司有这样的滤器的，找试剂代理商咨询一下就可以了) Q9 c" f+ H2 X3 S. l9 C
2.ES的贴壁性还是可以的吧，你洗涤的时候动作轻柔一点，上摇床的时候转速慢一点，加洗涤液的时候从皿壁上贴壁慢慢加

---

作者: 李夏    时间: 2012-8-21 14:45

回复 fish_zbw1985 的帖子% e2 W$ }& L& b! [: T

' ^  d2 c: P5 d5 q/ u( ~+ Z! P非常感谢您的答复，我做免疫荧光检测的时候用的是96well，为了省抗体，具体步骤是这样的：
/ f. g6 a4 I& R. m吸出培养液，PBS洗涤两次
0 |7 W: j$ i, h  T4%多聚甲醛固定hESC 5min
: d4 E# ~; `4 A# c6 i# k, p3 B; qPBS洗涤三次，每次5min
7 p% G' o! N  p* X, X" Y* ]* l0.1%Trion-X100/PBS通透细胞膜5min,PBS洗两次
+ p( r1 C5 C1 d7 D! U, N' c: Y3%BSA/PBS室温下封闭1h
  Z! L( C' R: y0 M6 [- d8 l孵育一抗(Oct-4,SSEA),室温4h4 T" b/ V6 U8 c% P# Y
吸出一抗，PBS洗涤3次，每次5min* Y. R' |: g( v7 [( B- w- B
孵育二抗,室温1h0 F0 @7 {( E7 X2 o+ d4 B
吸出二抗，PBS洗涤三次，每次5min
$ x' c. A2 W6 Z' s0 [" }不知道这样做有没有什么地方不妥的，望您不吝赐教，非常感谢了

---

作者: 李夏    时间: 2012-8-21 14:46

回复 jhu132llh 的帖子+ L& n3 i2 z% ]) c
" k# B: h+ t: |) T
非常感谢您的答复，我做免疫荧光检测的时候用的是96well，为了省抗体，具体步骤是这样的：
  Q# o2 e: a/ L2 [, {4 |7 s: S吸出培养液，PBS洗涤两次
9 }" ~; T, {1 I6 m9 o4%多聚甲醛固定hESC 5min" [$ t0 `! m+ b2 K
PBS洗涤三次，每次5min" V6 e) \/ p5 D
0.1%Trion-X100/PBS通透细胞膜5min,PBS洗两次
; q3 J' A/ o' h3%BSA/PBS室温下封闭1h
8 y: ~4 d: B$ I4 @& q0 ]1 S" e5 N  y孵育一抗(Oct-4,SSEA),室温4h
; S& @. d( e8 T. ]吸出一抗，PBS洗涤3次，每次5min
6 A' [, Z8 r8 u9 o* g# M孵育二抗,室温1h
2 y7 |2 k7 t8 w; `# U$ Z  L吸出二抗，PBS洗涤三次，每次5min
- t: p2 f$ l9 A4 o2 @9 m不知道这样做有没有什么地方不妥的，望您不吝赐教，非常感谢了

---

作者: jhu132llh    时间: 2012-8-21 21:39

回复 李夏 的帖子
% X2 [$ U6 a4 {: H: O& Q, p9 m0 M
4 R+ `& K- K) P7 x: n  Q方法看起来是没问题的; _" w. ^. H% t# u& s, k
可是你说的省抗体我倒是没看出来; Q2 S# U- K: ~! z2 u; d
我们做的细胞的爬片然后在做染色的时候只需要几滴抗体就可以了

---

作者: fish_zbw1985    时间: 2012-8-21 23:31

回复 李夏 的帖子
2 H! y5 }4 H# R' c2 B# G1 c+ e4 v
/ W! d9 C, F/ s3 @2 @5 O4 _固定时间不够 用96孔板确实不好操作  特别是ES细胞都是成克隆样的  个人觉得至少需要用48孔板

---

作者: chenks    时间: 2012-9-8 22:44

回复 李夏 的帖子
5 Y* S% f! T3 Q! \: U; Z1 S& o
3 L) d: c' }% |固定时间可以延长一些到半小时.另外用24孔板后者48孔板,放入玻片也很省抗体的模拟可以试试.
6 D( r8 F/ o4 }0 Y还有一个问题你的细胞有无Feeder;如果有Feeder的话,基本上细胞是不会掉的;如果无Feeder,就会掉很多细胞.

---

作者: 李夏    时间: 2012-9-8 23:11

回复 chenks 的帖子5 ~* g. r5 D! b0 c# M2 a5 o1 P

: H' N0 w$ _0 c. f非常感谢您的答复，我用的是无血清无feeder培养法，培养基为N2B27+LIF+MBP4，因为我养的细胞主要用来筛药，所以不能用血清和feeder，否则就说不清是我的药物的作用还是feeder成分的作用，所以细胞就不是很容易贴壁，而且传代两次细胞状态明显不行了，所以很是苦恼啊

---

作者: 白巧克力    时间: 2012-9-9 00:24

回复 李夏 的帖子
' t- ]4 n: `0 g" q. o1 p2 d- g0 I, c# i
我也是筛药的，不知道我们是不是很近...你一直用无feeder的，应该条件比较稳定了，其实可以考虑用CCM促进贴壁，只是要设个空白。

---

作者: 李夏    时间: 2012-9-9 09:49

回复 白巧克力 的帖子5 Z7 H( ^# B5 q3 R$ l

1 m9 \$ e. k8 ?1 gCCM是什么啊，我没有用过，能传授一下吗？其实我的条件不是很稳定，但没有办法，只能无feeder养来筛药。请问您是什么条件的培养基来筛药的呢？期待您的答复

---

作者: 李夏    时间: 2012-9-9 09:54

回复 白巧克力 的帖子0 C% n1 j* c0 g0 ?, `# o
+ H* a7 V3 P0 {: y0 f) W
请问CCM具体是什么呢？我没有用过，想请教一下。
6 |) P* |4 o5 d5 v其实我的应用条件不是很稳定，经常重新复苏细胞，但是由于筛药没有办法只能用无feeder培养。这里我很想知道您是用什么条件来培养细胞进行筛药的呢？期待您的答复

---

作者: chenks    时间: 2012-9-10 11:12

回复 李夏 的帖子. q; J6 x7 t- }/ W
) l# y% V( v( a6 ?  }% @# w! s
无Feeder的话,我就用六孔板,铺大玻片,但对应的抗体用得就比较多

---

作者: 李夏    时间: 2012-9-10 18:09

回复 chenks 的帖子
' d' R- V! o% a- W" g
3 Y1 t" v7 U6 l; Q! h& r6 Z0 S2 _9 J想请教您大玻片是可以直接买到的吗，就是做免疫荧光专用的吗？是不是这样就可以不用铺明胶了啊？我之前都是先铺明胶再铺细胞的，期待您的答复，万分感谢！

---

欢迎光临 干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)

Powered by Discuz! X1.5