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标题: ficoll淋巴分离液分析骨髓间充质干细胞 [打印本页]

作者: qiugt0819 时间: 2012-8-24 13:15 标题: ficoll淋巴分离液分析骨髓间充质干细胞

[attach]45379[/attach]，有明显的三层分层，但看不到传说中的狭窄白膜层，然后我在红白相间的地方抽取了约2ml液体（计数板每个视野约50个细胞），加pbs800转离心5min，弃上清，再细胞计数却发现没有几个细胞了。问题：没出现白膜层是否跟离心参数有关，加PBS离心是否因为2ml中有淋巴液，结果细胞又悬浮在上清液中被弃掉了呢，希望各位不吝赐教。

作者: katysong 时间: 2012-8-24 17:12

初步感觉应该是离心转数太小了，一般是2000rpm/20min/25度；而且一定要用慢升慢降的离心机；一般都能做得出来的，祝好运！

作者: wangzhiqi86 时间: 2012-8-24 17:36

你计数发现视野只有50个肯定不正常，因为MSC占单核细胞的比例只有百万分之一，也就是说如果抽到的是白色层单核细胞，应该整个视野下面都是小的细胞，不知道你有没有这个照片。; X5 X- H- q+ W' L0 }! |: A
还有，你把骨髓冲出来的悬浮液加到ficoll里面，有没有具体的操作步骤，不然只给一张图片不能说明问题。" A! E# M; A" c3 {. V: V
上面的培养基颜色很红，不知道为何？我当时上面只有单单的红色，中间的白色层在轻轻晃动离心管后，明显随着一起摇动。

作者: 小猪快跑 时间: 2012-8-24 18:27

转速太小，本来细胞量就少，转速还那么小，平时消化细胞离心的时候还得1200呢，淋巴分离怎么也得2000转吧！

作者: qiugt0819 时间: 2012-8-24 19:21

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谢谢，第一次发帖，图片前面的文字没有显示，操作过程：小型猪骨髓&DMEM稀释液和分离液按1:1，转速3000R15min就出现图片的结果了，但是就没有明显的白膜层，不知3000R15min是否需要改进

作者: qiugt0819 时间: 2012-8-24 19:22

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谢谢，第一次发帖，图片前面的文字没有显示，操作过程：小型猪骨髓&DMEM稀释液和分离液按1:1，转速3000R15min就出现图片的结果了，但是就没有明显的白膜层，不知3000R15min是否需要改进，800转5min是想洗一遍细胞用的

作者: qiugt0819 时间: 2012-8-24 19:28

回复 wangzhiqi86 的帖子( U! |1 V- z( U* j
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谢谢，第一次发帖，图片前面的文字没有显示，操作过程：小型猪骨髓&DMEM稀释液和分离液按1:1，转速3000R15min就出现图片的结果了，但是就没有明显的白膜层，不知3000R15min是否需要改进，细胞计数的图片没有保留，你的意思是单核细胞应该很多吗，那MSC形态与其他单核细胞一般怎样辨认呢？

作者: wangzhiqi86 时间: 2012-8-24 20:21

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稀释液是怎么加到Ficoll里面的？& _5 U, n: y% @( y/ j9 |
单核细胞当然应该很多，换液后就可以发现MSC可以贴壁，其他细胞会被换掉，过几天就看到了

作者: bsx1111 时间: 2012-8-24 22:28

看图感觉你的骨髓细胞量太小了，细胞肯定要少，建议你用直径小一点的离心管试一试，再有离心机要用带缓降功能的，降速太快，层容易散。

作者: qiugt0819 时间: 2012-8-25 00:50

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稀释液用加样枪每毫升加到ficoll液上的，但还是感觉会混到一块

作者: lxm5668 时间: 2012-8-25 09:04

1."稀释液用加样枪每毫升加到ficoll液上的",你这一步改成用移液器，选一个口粗的的巴斯德管，沿着管壁慢慢加到ficoll液上，管子稍微倾斜，加完后再垂直过来，操作要慢；
2.最后那部离心转速要加大到1500-2000rpm,时间也延长，单核细胞毕竟较小。
3.骨髓冲洗过程再仔细点。试试。

作者: qiugt0819 时间: 2012-8-25 22:10

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好的，谢谢，下周再试一次，希望能有好结果

作者: crazytime 时间: 2012-8-25 23:57

感觉标本量相对有点少，所以白膜层才会不明显

作者: wangzhiqi86 时间: 2012-8-26 11:08

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需要缓慢逐滴加入，越慢越好

作者: fenglinzhu 时间: 2012-8-26 20:38

一般ficoll都是500G到700G，20到30min缓升缓降，尤其是减速度越慢越好啦。加样的时候可以用电动移液器5ml移液管，第一滴一定要加好，然后就会比较好加了。分离效果的好坏与细胞密度有关，但图片上看的话红细胞应该不多，所以应该不是细胞密度的关系。从图片上来看，没有明显的灰白层，分离效果相当差，如果分离效果好的话灰白层是很明显的。在这种情况下一般吸取红白层中间的那4ml（用15ml离心管），取2ml少了点。还有就是你才50个细胞，还用PBS洗一遍那细胞肯定就很少了的，离心得再好悬液中也会有很多细胞残留的。

作者: jxaf3900824 时间: 2012-8-27 09:12

水平离心，离心力800G就可以了

作者: katysong 时间: 2012-8-27 13:12

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1. 建议稀释比例为: 小型猪骨髓：DEMEM：分离液=1：1：1
2. 你在加入稀释液的时候，先把装有淋巴细胞分离液的管子倾斜到一定的角度（45度角差不多，或者角度可以再小一点）；然后再用加样枪加入稀释液（1毫升枪的冲力比较大，可以考虑用吸管或是将1毫升的枪头用无菌的剪刀剪去一小截，可以减缓冲力），小心加入后就可以形成临界面，之后再加起来就方便很多，第一下是最重要的！
3. 随后再配合前面说的转数(2000rpm)、温度(25摄氏度)和时间(20 min)，相信你肯定能成功的，祝好运！

作者: romanyuo 时间: 2012-8-27 16:18

淋巴细胞分离液如果效果不好，可以进行全髓培养，利用贴壁培养进行筛选MSC

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