干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 关于慢病毒转染人脐带间充质干细胞的问题。polybrene、MOI值 [打印本页]

作者: quge_00 时间: 2012-9-2 23:09 标题: 关于慢病毒转染人脐带间充质干细胞的问题。polybrene、MOI值

最近在做慢病毒转染脐带间充质。有做过的，请教一下。
1、包装细胞接种第二天融合达50%，文献有报道到70%再转染，50%效率是不是高些呢？7 U* a; r$ A- [9 e
2、为什么要用无双抗的培养液配制病毒液呢？
3、转染前用293细胞测滴度不？
4、文献报道MSC使用慢病毒转染MOI值比较高（10），并且同时还加入了polybrene（8ug/ml），请问您操作时加吗？还是自己梯度摸索呢？" Y4 F5 Z/ v* A5 x+ p
0 i8 U( m7 @ S1 y. B
6 u) h% I9 |9 E+ R9 P) |$ N7 ~- F0 S
问题很多，见谅啊~~很是头疼，因为做了一次，没有明显的转染阳性的。。。。

作者: jhu132llh 时间: 2012-9-3 08:13

1.50%和70%效率上差不多，到那时50%的更方便一些，因为慢病毒表达比较慢，一般是转染后2-3天才筛选的，所以50%的要好一点的；
2.理论上，培养液含不含双抗和相应的生长因子对病毒是没有影响的；有的时候，慢病毒转染还是使用完全培养基的；
3.一般在纯化慢病毒的时候就已经检测滴度了，所以一般是不用重新测滴度的，除非病毒在-80度冻存超过8个月，一旦冻存超过8个月，最好是重新做个滴度；
4.可以做个梯度MOI，所有人的MSCs都会有点差异的，所以条件不能完全通用，所以最好是做个MOI梯度摸索一下最佳条件；: A1 S; S" ~7 y; d
5.polybrene是一种带正电的小分子，可以有效中和细胞表面携带的负电荷，有效提高转染效率至10倍左右，可以试一下不加和加，然后加8ug/ml和6ug/ml两个条件；

作者: chentian820 时间: 2012-9-3 08:35

就我最近的经验分开解答。  V: f7 |& Z2 ^2 H  O% D
1 293细胞密度在50-80%均可进行包装。包装效率最关键的还是包装细胞的种类和转染试剂，如果你的包装细胞用钙转不理想，建议你直接用lipo2000转；. i, ^9 J: k# B1 @
2 我的培养基里面是加正常抗生素的1%。有的时候也不加抗生素。其实抗生素影响的主要是你的转染效率，而不是直接影响病毒的活性。# x  _* h. J* _
3 不用测滴度。测的滴度也是相对滴度。仅作为参考。1 D: D0 C7 o- G( o. L  L9 }
4 我使用的polybrene浓度是10，感染后12h换液。

作者: quge_00 时间: 2012-9-3 13:00

回复 jhu132llh 的帖子
! @7 [, d7 x! _
多谢解惑啊~~~

作者: quge_00 时间: 2012-9-3 13:00

回复 chentian820 的帖子 ~+ T9 ^0 o# ?) {9 s- D

学习了啊~~

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)