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标题: 现在胰酶消化细胞效果很差，求大侠指导 [打印本页]

作者: dc1818 时间: 2012-9-14 13:34 标题: 现在胰酶消化细胞效果很差，求大侠指导

我现在用0.25%的胰酶3ml消化T25的瓶，四分钟的消化效果都不好，吹打也没多大用，不知道哪位大侠有更好的办法吗？

作者: sdwzg119 时间: 2012-9-14 13:44

胰酶放了多久了？突然出现的情况吗？一般胰酶4℃不能放太久的~ y3 N% f8 L4 w$ M% ~

还有，你培养基洗干净没？没洗干净也消化不动。

作者: dc1818 时间: 2012-9-14 16:16

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胰酶应该在一月之内，培养基就是用移液管吸干净了，没有用生理盐水冲洗

作者: 634996425 时间: 2012-9-14 16:21

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我建议您配制TE溶液：0.25%胰酶+0.02%EDTA，不要放到37℃，直接放到室温45min左右即可，操作过程中记得把我好消化时间，胰酶如果每次都预温用不了下次再用一热一冷酶活性会降低的，希望对你有帮助

作者: dc1818 时间: 2012-9-15 10:20

回复 634996425 的帖子2 K' v! W' l- K* x2 v r
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多谢指教，我用你的方法试试看

作者: bsx1111 时间: 2012-9-16 07:26

我建议你用生理盐水冲洗一次到两次，洗去培养基中的血清，在用胰酶消化

作者: 细胞-77 时间: 2012-9-16 09:51

胰酶还有活性吗、还有，你培养基洗干净没？

作者: sdwzg119 时间: 2012-9-17 09:18

回复 dc1818 的帖子& `! P+ B, W- }: d" p7 E

一定要洗至少两次再消化的，你下次洗完以后再消化，估计就没问题了，养细胞不能省事的~

作者: jensn 时间: 2012-9-20 22:05

首先，必须有PBS或者HBSS缓冲液彻底的清洗培养瓶中残余的旧培养基，不然以为加下去都被中和了。再者，加入胰酶之后，需要放在37度培养箱中孵育个一两分钟，跟胰酶的最适温度有关。另外，有些细胞本身的特性问题，在我们实验室就发现，同样是培养原代骨髓间充质干细胞，C57老鼠就比BALB/C的要好消化，人脐带的间充质干细胞就更好消化。这个原因我想可能跟不同种属的实验动物，其原代细胞的均一性有关。

作者: dc1818 时间: 2012-9-21 07:59

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放培养箱消化挺有意思的，下次试试

作者: jensn 时间: 2012-9-21 09:17

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嗯，还有一点，可以说是个人的操作习惯，说实话我也不知道好坏，就是在镜下观察细胞消化程度的时候，我会边观察边晃动培养瓶，这样有助于细胞成片脱落，促进消化。

作者: 回到从前 时间: 2012-11-2 10:54

关键是看你的细胞形态怎么样？胰酶消化3分钟应该没问题的，如果真的是MSC很容易消化的，怀疑是不是杂细胞啊？

作者: prophe 时间: 2012-11-2 12:44

建议用生理盐水冲洗至少两次，洗去培养基中的血清，再用胰酶消化，37度最好，胰酶推荐使用Amersco的，国产有些公司自己配的效果不好，当然还得看你的细胞类型了，有些细胞是不好消化。

作者: 希望之光 时间: 2012-11-2 13:34

哎胰酶就是37度才有活性的细胞培养基本常识啊5 c( s, C& _. X, F6 f- b/ i: ~6 `

作者: SKC-SFC 时间: 2012-11-2 14:42

问题应该主要出现在胰酶本身的活性方面，比如本身浓度是否合适，是否放置时间过久。我们实验室的胰酶T25加0.5mL消化2分钟，细胞全部都脱落了。另外因为酶在37活性是最强的，所以一般大部分细胞在37度更合适一些。

作者: huangcong1988 时间: 2012-11-2 16:03

先倒掉培养基，然后用PBS洗净，就是加入PBS，晃动一会然后倒掉PBS。然后加入胰酶，一般T25瓶加入0。5ml左右就够了，您加3ml是不是多了？不过也看细胞类型，有的细胞贴壁特别紧可以多加点，但是消化时间一般就2min左右，细胞加3ml胰酶消化3min着实很少见

作者: dc1818 时间: 2012-11-3 09:35

回复 huangcong1988 的帖子8 d0 Z# ?; `* I, u* u A

但是就算消化3分钟，细胞还是有很多消化不下来啊

作者: bibottll 时间: 2012-11-3 15:41

要把培养基洗掉啊，你培养基里有血清的话能消化好么

作者: Donnies 时间: 2012-11-22 15:19

你是直接在室温下消化的还是放到孵箱中，如果一直放在室温下进行消化的话，建议放到孵箱中，在37度的孵箱中有助于消化，一般细胞消化一到两分钟即可，如果你已经放在孵箱中进行消化的是，是不是胰酶放了很久了，或者你加的胰酶太少了，如果还是不行的话，你可以把培养基吸出之后，用胰酶将培养瓶洗一遍之后，再加入胰酶，这样的话，一般都可以达到目的的。

作者: dc1818 时间: 2012-11-23 08:58

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非常感谢你的指导，我现在就是放到培养箱中消化的，效果不错

作者: 445334587 时间: 2012-12-17 12:14

洗一遍，去除残余培养液，以免培养液中和酶，

作者: Donnies 时间: 2012-12-18 15:25

先问一下你的胰酶已经多久了呢，如果很久的话，消化不下来也是正常的，如果是新的胰酶，对其他的细胞消化很好的话，你可以先用胰酶洗一下细胞，然后进行消化，或者直接将培养基吸净之后加入胰酶放入孵箱中，然后进行消化

作者: avacfr 时间: 2012-12-18 15:43

首先，一定要用PBS或者D-Hanks液冲洗两遍，其次加入温的胰酶（可量大一点，晃动覆盖细胞层面然后吸出一部分），消化过程中来回晃动，使胰酶覆盖细胞层，消化会更均匀。个人觉得主要原因是你没有冲洗细胞，仍有培养基（血清）残留中和了胰酶的作用

作者: lcw918 时间: 2012-12-20 11:03

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就是这一步，你要洗啊洗啊洗啊洗，不然残留的培养基，里面有血清，会终止胰酶的。洗干净之后再看，会发现好神奇

作者: yanleijeff 时间: 2012-12-25 22:37

最好用PBS冲洗将培养基冲洗干净，否则培养基中残留的血清会中和胰酶的作用。

作者: q838903017 时间: 2012-12-30 18:45

培养基会终止胰酶的作用所以必须用缓冲液洗至少一次，胰酶在37度作用最好，这样一般消化都不会有问题，对于消化的时间不同的细胞系也不同

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