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标题: RNA电泳，求解 [打印本页]

作者: runsong 时间: 2012-9-15 23:15 标题: RNA电泳，求解

第一次做体外转录，加帽，没加尾。浓度1300ng/μl
然后用1%的普通胶电泳。" W. ^3 T: G! ~' _7 H
根本木有注意电泳中RNA酶的问题，木有甲醛，啥都木有注意。
跑成了这个弥散带- j7 }# n# B- g s6 O* n8 r
想问：
1、标准的体外转录产物电泳加不加甲醛，是否用5%的胶影响大吗？
2、我的片段是不是降解了？是电泳过程中的，还是本身就降解了？

注：没有RNA marker，DNA marker 也没有，本人根据经验，产物大小若以DNA marker判断大概有1000-1500，我的目的片段应该是2000nt。

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作者: dianying 时间: 2012-9-16 11:05

回复 runsong 的帖子8 [0 }$ U: o; V0 {" `

看起来像你的样品本身降解。

作者: ying 时间: 2012-9-16 11:32

质粒模板要酶切线性化之后用蛋白酶K消化，酚抽，乙醇沉淀。转录时一定要加RNAse抑制剂RNAsin。全程要无RNAse。4 c7 p( j0 ]& M' I, }
我觉得你这是转录时有污染。是不是没有加RNAsin啊？一般不会是跑胶的时候坏的。 L0 K# c) q5 W7 U$ X+ W/ j- k$ U
我做的按你这一样的条件跑胶会是一条或两条带（两条带可能是非变性的情况下有二级结构），都是好的。2 M" Q- x/ S' z4 D& V2 F

作者: runsong 时间: 2012-9-17 21:17

我将质粒模板酶切线性化之后用的，之后胶回收。9 `: q! w( D4 z* K4 S8 U
盒子用的mMESSAGE mMACHINE Kit，里面有RNA酶抑制剂。 Z, Y5 Q3 `2 H8 m
你的意思是我的样品RNA酶污染了吗？

作者: weiyepan 时间: 2012-9-18 04:59

RNA电泳跑1~3%琼脂糖TE电泳本身是没问题，问题是如果你用的是平时跑质粒的电泳槽和buffer的话，里面本身就很多Rnase（miniprep kit里面带的）。所以，想偷懒不做甲醛电泳的话，最好跑之前把槽洗干净，新胶换新的buffer跑。8 y) Q7 c/ k8 s! E6 N( a
另外RNA是单链有2级结构的，如果不做变性电泳，是看不出准确大小的，而且本身RNA和DNA糖环分子量大小也不一样，我不知道你连marker都没点怎么样看出大小的。。。" s% Q& Y2 |5 g6 t; N) | A4 J* }

作者: ying 时间: 2012-9-18 08:47

回复 ying 的帖子

我个人觉得像。MMkit里面有阳性对照质粒的，你可以按照上面的trouble shooting做一下嘛。带上pos.ctr
我质粒线性化之后是要做PK消化和酚抽乙醇沉淀的。RNAsin只能干掉少量的RNAse，要是RNAse残留太多还是不行的。一般实验室RNAse主要来源就是小抽，你的枪最好洗一下。

作者: 细胞海洋 时间: 2012-9-18 23:40

回复 runsong 的帖子

你回复谁就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容像我这样
% k: S S& E$ t2 l
否则他会看不到

作者: huangxf1998 时间: 2012-9-29 09:00

你的应该是做出来了。
只是你的照相水平有待提高，对焦啊！7 j' Z8 g7 ^$ L* }& X {

但是，侥幸跑出来不等于以后也会跑出来。楼上同行的话应该好好记住呀！

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