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标题: 脐带间充质干细胞形态求分析 [打印本页]
作者: huajie881026    时间: 2012-9-24 09:34     标题: 脐带间充质干细胞形态求分析

养了几次脐带MSCs，细胞总是老化很快，前些日子也在版内发帖求助了一番，有大侠跟我说他一条脐带最多能传40代，这对我目前的状态来说简直是不可想象，所以想改进细胞培养方面的技术。在此麻烦大家伙指点一二！
/ G% P) {, R& E8 u( Z# g3 Z& A: a想请问：我用的是DMEM-LG+10%FBS+1%双抗，一定需要加bFGF吗？
& y  r# T9 D$ e' j% q! T胰酶现在的消化时间控制的还可以，昨天看到有文献说用0.05%胰酶消化1-2min的，我又一次怀疑自己的胰酶是不是加多了。我一般0.25%胰酶+EDTA在T25培养瓶里加500-800ul，之前PBS洗了之后培养瓶里留0.5ml左右，相当于等比稀释胰酶，这样消化约1min，然后终止消化。; L# W4 C! c9 G% ^
我想找出更多影响细胞状态的原因，求指点！  j+ F' U$ ~: B( J+ I! _
下面是我养的图片
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作者: gghywtfz    时间: 2012-9-24 10:55

我觉得最大可能是因为你使用的血清并非筛选过的血清。
' p7 Z3 O* |5 I, v3 d- E8 I另外，可以在培养基里加进去2mM L-glutamin
8 b1 @; Q6 I, A# w; M6 V2 p一般MSC对L-glutamin比较敏感。
  X4 w) ?3 L7 u# W& k* J& k& O  J! |! @4 q. F: y
作者: willing    时间: 2012-9-24 11:52

我养脂肪间质干细胞有同样的困扰。。。。求解答。。。
作者: ind6562    时间: 2012-9-24 13:36

如果你想让细胞活力更好，最好加加bFGF。
  _3 M6 P: I* P$ r) T把种瓶密度调点，间充质细胞要保证细胞间的接触活力才会好。当然原代细胞不好调整密度，但你可以早点传代，不一定要等它们长到80%的汇合度，你这一等，细胞可能就老了。
作者: ind6562    时间: 2012-9-24 13:37

不好意思，是种瓶密度调高点
作者: SKC-SFC    时间: 2012-9-24 15:01

从你的细胞图片来看，并没有多老，属于正常情况
作者: huajie881026    时间: 2012-9-24 16:41

回复 ind6562 的帖子5 B# R. W8 T. j3 q8 I& n
" l& @0 q: g5 Q' b+ S8 M" Y1 a
我一般是5000-10000cells/cm2，5天左右可以传一代。
4 l! }7 v" b0 `9 CbFGF是重组人bFGF吗？
作者: huajie881026    时间: 2012-9-24 16:49

回复 gghywtfz 的帖子
* r, m8 o+ c: E& }$ V0 U( d4 f! K# y
我用的是GlutaMAX，长效的: R* y* h% _" b  |4 L9 @) a& c: }" L
血清的话的确是没有筛选过的血清，请问哪个公司有适于这个细胞生长的血清呢？
作者: 流泪的鱼    时间: 2012-9-24 20:57

你中和的方法考虑到了吗？这步是细节，也很重要。我以前曾经犯过小错误，导致传代后的细胞长势不好，好好注意实验的每一步骤。
作者: ind6562    时间: 2012-9-25 20:22

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! {' u$ r' `) K8 D
# x- Q& t, ^4 Y' R. P我们一般种的密度是500000CELL/T25培养瓶，这样算下来是20000cells/cm2，你的密度我认为是偏小了。* x+ h5 R1 ]0 t6 g/ B  a
我没用过bFGF，有同学用的说是重组人bFGF，但你买之前应该自己先了解下。
作者: huajie881026    时间: 2012-9-25 20:34

回复 ind6562 的帖子+ `  {7 K* f* K* r
' ]& z. j+ h( Y: ~3 O: B
种的密度20000/cm2也太大了吧，这样岂不是没两天就能传代了，我认为5000-10000/cm2足矣，文献中看到也多是这个密度$ }% \7 {3 |8 O* G$ A: ?
bFGF有查过protech的，打算买一点加进去试试！
作者: asa_ok    时间: 2012-9-26 13:58

接种密度有些高啊，这样细胞生长就会有个接触抑制效应。
. z' x! c: c6 v$ Q& I; @- Y3 f% ?我们还加invitrogen重组人源性bFGF、EGF。
作者: huajie881026    时间: 2012-9-26 14:13

回复 asa_ok 的帖子0 T7 w5 K: s0 F' C5 {+ ^
9 u# E) Z$ v  Q; U$ M7 C8 A9 t
哦 不好意思   这个不是接种的时候的   是长了两天的
作者: weibin2002    时间: 2012-11-3 22:16

我以前养骨髓的msc，好像血清不好不好就容易出现这种情况。
作者: 笨球球开心    时间: 2012-12-3 09:56

请教原代脐血间充质细胞培养液添加成分，我培养原代已3周了，仍未见明显漩涡状，只有少量成纤维状改变。
作者: 细胞海洋    时间: 2012-12-4 11:17

回复 笨球球开心 的帖子3 q8 e$ I% @0 e; v1 r  |

/ X# |" m/ O& B1 o# a$ ^- w# n建议你发新帖提问
作者: huangcong1988    时间: 2012-12-4 19:38

感觉中间那张细胞状态也不是很差，就是第一张跟最后一张细胞密度稍微小了点，中间那张的话，细胞形态差不多。视野里面看的话，感觉还是有点脏，我也老是遇到这样的问题，就是换液前，细胞看上去还是有些脏，就是那些黑点，也不多，但是老有
作者: ditiger    时间: 2012-12-4 21:54

感觉状态还可以啊，做个β-GAL试试，估计阳性率应该不高吧。
作者: luckywen    时间: 2012-12-4 22:11

本帖最后由 luckywen 于 2012-12-4 22:13 编辑 3 k7 \% A. [4 q. j% B5 V& t; D1 E
1 I4 W+ ?$ d% Y( H7 e& K
回复 huajie881026 的帖子: a, Y. W( \! ^

2 [( u) u. t4 h: T) i( r: z- O看照片细胞形态挺好的，不知道困扰楼主的“老化”是什么情况？与原来未老化有什么不同呢？会不会是细胞接种密度过低导致的变化呢？
作者: caiyu07248    时间: 2012-12-5 09:45

回复 huajie881026 的帖子
: ~& s& Q6 Z  r8 a6 D6 A  e! x
) P" |/ b5 z4 s% j之前养胎盘来源的时候有过筛选，筛选下来的是BIoind的金牌间充质干细胞胎牛血清，相对来说在增殖和形态方面要好些。
作者: caiyu07248    时间: 2012-12-5 09:48

回复 ind6562 的帖子
3 v! @0 T& u. ?; a( |9 H7 x# V" w1 {* F1 i1 c% X) u; D
你这个密度也太高了吧，按照你的接种密度那细胞不是长个两就可以传代了。我的接种密度是6000/cm2,150000cells/T25，基本上长个四天就可以接种传代了。
作者: 小公    时间: 2012-12-5 09:55

回复 笨球球开心 的帖子
& y* f/ A* I/ p$ G% l; N- ~  L% a' d) n
你好，我也要开始养 脐血的间充质干细胞，发现很难养活，能把你详细步骤给我看下吧，交流下，谢谢
作者: huajie881026    时间: 2012-12-5 10:30

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9 Y! A8 ^1 N, H4 o0 N8 A, ]" y/ b9 \( K$ P) y
嗯  我赞同！
作者: 回到从前    时间: 2012-12-5 10:33

我感觉你的P0养的时间有点长了吧？可以看看3天左右传代试试？我们做脐带的MSC，血清的批次会有很大的影响，再就是摸索下传代的方法
作者: 笨球球开心    时间: 2012-12-7 08:17

回复 小公 的帖子# G. n( _; [- {* F
! m: Y) S* u: y" n
我的也没养活，提取的是细胞处理试剂盒（步骤见说明书）；培养是D/F12+15%胎牛血清，7天首次换液，3-4天半量换液，现还在探索中，你的呢？？用是怎样方法提取，什么样培养基？？
作者: 笨球球开心    时间: 2012-12-7 08:24

我是请教我的原代细胞现在长得太慢，是否要加BFGF？
作者: huajie881026    时间: 2012-12-7 13:14

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8 l' [# k+ x. M3 t% y3 V4 J* \: X, p' a# `$ N, f
嗯 加了长的快，我现在就加了。。。
作者: 笨球球开心    时间: 2012-12-7 15:35

你说什么加的？有前辈说刚有成纤维样细胞时就加？你的培养液和我的相同？如果不，你用的是？？谢谢！
作者: huajie881026    时间: 2012-12-7 20:41

回复 笨球球开心 的帖子! q% t8 v; G9 ]7 Z: V5 y+ x

% s+ E- X' _! f+ x0 E4 s) ADMEM-LG+10%FBS+1%PS+4ng/mlbFGF
作者: 细胞海洋    时间: 2012-12-10 09:25

回复 笨球球开心 的帖子. G! t. U" _( S2 h/ }( q) _
5 j0 ?- S& C2 V) v4 O- ]: K
你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样+ Y' t5 O& [! t
2 f; j/ J4 o. k+ |; W
否则他会看不到
作者: wind789    时间: 2012-12-10 09:56

本帖最后由 wind789 于 2012-12-10 09:58 编辑 / x% D! l  X4 A! {$ }) G( y
huajie881026 发表于 2012-9-24 16:49
& a+ {3 E7 ~7 S! Y8 y9 g! A) p. U: k回复 gghywtfz 的帖子( m% w# y9 x9 T9 N. O9 Z
$ ?1 h# Y# E, P
我用的是GlutaMAX，长效的

9 K* V( E  |  h$ r! J( x
8 ?; ]+ D* J+ x$ F! z我用了HYLCONE筛选过的血清，状态改善不多。我个人认为减少血清浓度？血清的营养物质也有诱导老化的作用。
作者: 荣荣荣    时间: 2012-12-10 10:41

我们在P0加人重组的bFGF,p1就不加了。
, J) Z% h! P3 b4 w: C再问个问题，我用GIBCO的胰酶，要消化4min才能都消化下来，不然不能单细胞，你用的什么酶1min就可以？我试过1min有消化下来的，但是不能消化下来的吹不下来，细胞量会减少很多。
作者: 细胞海洋    时间: 2012-12-10 10:51

你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样5 [7 {  i2 a& C* @- C

+ X0 S) d8 l! ^8 g7 f$ m3 g否则他会看不到
作者: deshenglll    时间: 2012-12-10 11:07

把接种密度调高点。密度稀了。
作者: 笨球球开心    时间: 2012-12-11 09:44

原来如此……懂了
作者: 笨球球开心    时间: 2012-12-11 09:55

ps是？？
作者: 笨球球开心    时间: 2012-12-11 09:57

回复 huajie881026 的帖子; j1 c0 z4 l9 X- a) Z

6 ?7 o+ y9 R" B' A6 m0 tps是？
作者: huajie881026    时间: 2012-12-11 10:29

回复 笨球球开心 的帖子
5 C+ l5 m# M( Q6 q: V- M: Z2 M/ i& e" C- G& {0 B: \' m
青链霉素
) R2 m( ~2 q9 ?  y, e5 U
作者: askage    时间: 2012-12-12 11:46

看图说话：细胞形态很正常。
/ d5 X$ G8 o# M! p& X) a别养太密，细胞接触容易引起增值、分化能力下降。
作者: 笨球球开心    时间: 2012-12-17 08:48

回复 huajie881026 的帖子
) T+ w. A  y: E& c# ]& i- C  c. I, U* I1 E  f9 E
你对脐血细胞行流式细胞仪的CD分子检测验证脐血间质干细胞？如果检测用CD多少？？
作者: 笨球球开心    时间: 2012-12-17 08:50

回复 wind789 的帖子
8 [* v' ~5 s7 b- R5 O9 p" x/ ?8 X, A; T, d
但是血清太低，细胞养不好……
作者: huajie881026    时间: 2012-12-17 10:36

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脐血的还没测啊   我这是脐带的，都一样的  用的是相同的抗体
作者: 笨球球开心    时间: 2012-12-17 15:46

回复 huajie881026 的帖子/ I- K4 f; @, C7 l

( a! D  K" N  K+ f5 Y' M, R! x, Q你选CD？有好多种，因资金不足，只能选几个，但不知道哪种阳性率高，文献各说纷纭……请教一下……谢谢！
作者: huajie881026    时间: 2012-12-17 16:17

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* t$ B3 [! ?) `6 N. v4 C
. K2 m2 G5 z, [3 W5 R: q4 g! V阳性的CD73，90，105，44.
. b% z6 e) l/ b阴性的CD11b，19， 31，45，HLA-DR
作者: yinfuhua    时间: 2012-12-17 17:02

回复 huajie881026 的帖子
; v7 c) \! m- Z5 ?
' u( s/ d3 |- w. p% s' _+ t7 ?我认为细胞状态良好啊。P1、P2的密度传代都可以。加bFGF长得会更快更好。
作者: thomassun2008    时间: 2012-12-19 14:42

bFGF是呈纤维样细胞生长因子，加了细胞会变成短梭样，细胞不会很快变得宽大。并且你用的是FBS培养的，消化一般0.25胰酶，37度温箱4-5分钟。而如果你换成人血清培养0.05胰酶室温1分钟就下来了，并且人血清培养的细胞会较慢出现扁平宽大样（一般p3,p4后才出现吧），建议你可以换用人血清试试。



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