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标题: real-time PCR的结果计算方法 [打印本页]

作者: daviddow 时间: 2012-9-26 22:29 标题: real-time PCR的结果计算方法

我想请教大家一个问题，为什么在real-time PCR计算结果的时候，是靶基因的值减去actin的值呢？为什么不是除以呢？

作者: 寒山拾得 时间: 2012-9-27 08:17

原理见附件。

图片附件: ddct.JPG (2012-9-27 08:16, 82.03 KB) / 下载次数 366
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附件: Delta T经典引用－Analysis of Relative Gene Expression Data Using delta T.pdf (2012-9-27 08:17, 773.23 KB) / 下载次数 65
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作者: wnavy200299 时间: 2012-9-27 09:21

这问题问的比较高深哈~~~~一直以来只知道所以，不知道所以然啊！

作者: jensn 时间: 2012-9-27 09:40

首先我们做real-time PCR 在软件上，比如ABI7500上会让你选择采用的计算方法，按楼主的意思，应该是选择ΔΔCT的计算方法，至于具体为什么是ΔΔCT，这个只能看文献了，涉及的数学模型的构建问题，我也解释不清了。接下来，既然我们已经选择ΔΔCT作为计算方法，那么可以讨论下内参的概念，在real-time PCR中，前面已经经过逆转录等步骤，为了去除不同标本在RNA的产量，质量，以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，通常选择内参来进行校正和标准化。内参基因的扩增可以反映RNA产量，质量和CDNA合成效率的变化。这时的内参，我们需要在同物种基因组中是稳定表达的某个基因，那么β-actin是比较理想的；在蛋白电泳中，还会涉及到GDAPH作为内参等。现在，我们来讨论下CT值得概念，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。反应在实例中就是，如果你设定了一个荧光阈值（假定是1000个荧光单位），那么可能对于β-actin在经过18次循环的时候就可以达到这个设定的荧光阈值，而对于你的目标靶基因，可能需要24个循环，也就是说你的目标靶基因要比β-actin多进行6次循环才能达到设定的阈值。那么对于另一个目标靶基因可能它只需多3个循环就能达到跟β-actin一样的设定荧光阈值。这样，不同的目标靶基因都减去β-actin的CT值，就得到了他们扣除实验因素后的相对基因表达量的差异数值。不知是否对你有帮助？

作者: sangwj 时间: 2012-9-27 11:08

PCR扩增是以2（理论值）为底数的指数函数，Real time 中的Ct值相当于指数，指数相减就是除法运算。

作者: think 时间: 2012-9-28 09:08

回复 sangwj 的帖子
/ O' N& N9 L! K' a8 Q& f
应该就是这样子的同底数幂相除就等于指数相减。

作者: 86964109 时间: 2012-9-28 10:00

ΔΔCT原理.doc (56 KB)

附件: ΔΔCT原理.doc (2012-9-28 10:00, 56 KB) / 下载次数 12
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作者: caifranklin 时间: 2012-9-28 11:37

楼上的传的什么呀，版主删啊！

作者: 冰罗布 时间: 2012-10-18 17:40

本帖最后由冰罗布于 2012-10-18 17:40 编辑 J2 \# K5 J8 P# @; {
! q1 [- K- S2 M+ j: X* E/ {
详见论文Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method。

作者: cnsder 时间: 2012-10-20 20:15

很高深啊

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