干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 脂肪干细胞养不出来 [打印本页]

作者: loveless 时间: 2012-9-27 18:59 标题: 脂肪干细胞养不出来

养了快3个月细胞，可是还是没收获。实验步骤都是按以前师兄师姐做的，怎么就养不出来呢？还请各位指点一下- s& H3 V- z9 b: I  u3 s
我的实验步骤：
  1、处死小鼠，75%酒精泡5min。
  2、无菌取腹股沟处脂肪，放入D-Hanks液中，反复冲洗。+ }* G: P% P/ L; d1 a) q+ A6 h( ^
  3、剪碎组织块，呈半流质状，然后加到离心管中，加入1ml0.1%胶原酶，37℃，30min，不停的震荡。; S8 `: P2 v4 s& Q4 f
  4、加入血清终止消化。离心，1300rpm，10min。
  5、弃上清，加入2mlDMEM，离心，1000rpm，10min。
  6、弃上清，加入全培培养。
3 V$ b+ E' G6 g. }
按这个步骤做了好久，没养出来，还请大家看看那个地方出问题了~~~谢谢！！

作者: amberma 时间: 2012-9-28 09:30

几号胶原酶？如果4号太温和了 30min 时间太短
试试胰酶10-15min. H/ h, F& |/ J1 O8 l2 c

作者: loveless 时间: 2012-9-28 12:10

回复 amberma 的帖子: [8 ]8 q, }0 d! g9 b
& {6 `% G, }( a; j. Q( s: Z. x
我用的是I 型胶原酶，30min。

作者: willing 时间: 2012-9-28 20:33

是没有细胞长，还是什么情况？

作者: loveless 时间: 2012-9-29 09:15

回复 willing 的帖子$ ~2 |' [4 }. ]$ \* m
3 Y9 \1 M* x8 B6 P' m
有细胞，但是很少，而且生长也很慢，原代十几天都不见长。

作者: 都市青蛙 时间: 2012-10-2 17:20

每次你能取到多少脂肪组织？
有没有留心胶原酶的作用浓度是否合适

作者: tangyihan 时间: 2012-10-3 09:38

回复 loveless 的帖子) \; T6 R. |/ Y: K0 A

可以考虑:
1.用0.2%胶原酶。
2.消化时间延长为1小时，这也是nature protocol上建议的消化时间。* l5 e# `% ~8 V' \( T
3.离心后用100um filter 过滤。# u. [: c' A$ M1 J2 u& n
4.你应该把步骤些详细些:不停的震荡是什么意思？没见过protocol这么写的。
5.发帖之前建议先看看其他帖子，园子里多着呢。- L8 w# e% o0 I2 N

祝你成功！

作者: loveless 时间: 2012-10-3 14:27

回复都市青蛙的帖子( E7 A) T( x% L" C* G7 r
/ [" M1 U$ m1 }9 \% ?" \* A+ d% m1 G
我用的是4~6周的小鼠，一只小鼠取到的脂肪很少，不到1ml。0.1%不合适？请问你是用多大浓度的？

作者: loveless 时间: 2012-10-3 14:31

回复 tangyihan 的帖子
0 y2 w; ?6 e* e$ c" {0 J1 \ v
请问你说的“消化时间延长为1小时”是指用0.1%的胶原酶还是0.2%的？“不停的震荡”就是用手一只晃，因为没有水浴振荡器，所以就人工震荡~~~~

作者: tangyihan 时间: 2012-10-5 09:42

回复 loveless 的帖子
% ]8 x; V1 U! K$ |6 c
用0.2%的胶原酶消化

作者: meister 时间: 2012-10-9 15:30

回复 loveless 的帖子
% H) ~2 a9 l: c* M
不需要水浴振荡器，需要空气浴摇床。 37度，必须的，手晃不成。

作者: stemcellmeng 时间: 2012-10-11 14:06

这是比较标准的Protocol了，如果改进的话，应该是在消化完离心之后，过70um的筛网去除大块的细胞。理论上应该是有细胞的，可能是你取的组织太少了，下次可以尝试多取一些组织，而且一帮组织多的话，酶量也需要相应增加，一帮一只c57的小鼠取的脂肪，可以用5ml的胶原酶来进行消化。不知道你的培液是不是按照标准的MSC培养液来配置的，而且别忘了加双抗，防止污染。

作者: 都市青蛙 时间: 2012-10-17 20:47

loveless 发表于 2012-10-3 14:27
0 T6 F# Q: z+ S3 i回复都市青蛙的帖子# P5 y. N" N9 P( Y

- |) `3 Z) s3 g3 b, i. y& |! X1 l% }我用的是4~6周的小鼠，一只小鼠取到的脂肪很少，不到1ml。0.1%不合适？请问你是用多 ...

我取的也是1ml左右，要重点关心你的胶原酶作用浓度，这跟配比浓度有区别

作者: chengge21 时间: 2012-10-30 09:22

用胶原酶I放在摇床上，37°C消化，消化时间延长到一个小时。消化完后，要用吸管反复吹打几次（很关键），然后离心去除脂肪上清，加入完全培养基悬浮细胞，用200目滤网过滤。过滤完后离心，然后去掉上清，用培养基悬浮细胞，培养就行了。

作者: tangyihan 时间: 2012-10-30 09:28

回复都市青蛙的帖子( Z% f x6 [+ N; e

个人觉得胶原酶浓度也不是太重要，虽然文献上基本都用0.075%或者0.01%的胶原酶消化，但我每次消化时用0.2%的胶原酶也很好，2g大鼠脂肪组织可以取到10的5次方的细胞，觉得胶原酶溶液体积应该在脂肪组织体积的3至4倍的样子，充分与脂肪组织混匀才能消化彻底吧，如有不足之处还望各位指出...

作者: loveless 时间: 2012-11-3 10:28

回复 stemcellmeng 的帖子

我用的是Balb/c小鼠，胶原酶加1ml，因为脂肪量只有0.2ml。我的培养基是买的Hyclone的高糖培养基。

作者: loveless 时间: 2012-11-3 10:33

回复都市青蛙的帖子
/ |; e* A9 m/ j2 E4 I" p/ H; c
胶原酶我也用过0.25%，但是还是没养出来。我用0.1%的养了人的脂肪干，方法步骤跟养小鼠的是一样的，就是脂肪量用了10ml，能养出来。可不知道为什么养小鼠的就是养不出来。

作者: xiaoyurly 时间: 2012-11-9 10:31

可以选择胖点的小鼠，周龄大一些对ADMSC活力影响不大，另延长消化时间到1h，原代铺盘时细胞密度一定要大，2d后即可换全液，一般3-4d可传代

作者: loveless 时间: 2012-11-9 19:52

回复 xiaoyurly 的帖子

周龄大小对ADSC没影响么？我用4~6周的balb/c很难养出来细胞，换成2天大小的SD乳鼠用同样的方法能养出来了，第2天就有好多贴壁的了。难道是balb/c小鼠脂肪干细胞少？

作者: cartoonyang 时间: 2012-11-12 09:28

回复 loveless 的帖子

1ml的量也太少了。消化时间延长到1小时，然后用枪头来回抽吸，再用100目筛过滤，再离心，再用培养液离心洗一遍即可。可以考虑48小时再换液。或者尝试用组织块培养法。

作者: loveless 时间: 2012-11-12 12:00

回复 cartoonyang 的帖子
! V0 |' V) j( ?2 E# i
balb/c的用组织块贴壁法也没养出来，SD乳鼠组织块能养出来，不知道是为什么。

作者: xiaoyurly 时间: 2012-11-12 16:43

回复 loveless 的帖子1 r" ~5 j7 h* s8 A, E
) A9 C! `' E0 T
我们实验室一直都用25-30g的雄性C57小鼠来提ADSC，周龄至少在9周以上，2只得到的细胞可铺一个10cm dish，长得很快，而且很纯，一般4-5天可传代，而后2天传代一次。用周龄小的小鼠获得的细胞数较少，需要4-6只才能获得一盘原代，就我们观察细胞活性基本没有区别。balb/c小鼠没有用过，不太清楚。我们的经验就是ADSC一定要密铺快传，这样细胞活力保持的比较好，否则容易老化，另外要用比较好的血清，我们用alphaMEM培养基，20% FBS。

作者: loveless 时间: 2012-11-15 15:27

回复 xiaoyurly 的帖子. ` h: g0 |3 C* R. L9 }

密铺快传？要是快的话，细胞还没长到80%。我原代的时候按1:1原瓶传的，P1第2天还感觉挺好的，就是数量不多，想让细胞长到80%传代，结果第4天就老化了~~

作者: sunflower636 时间: 2012-12-3 21:51

回复 loveless 的帖子

我也摸索了几个月才摸索出来，但是我不是做老鼠的。细胞少可能是因为你的标本量太少，另外胶原酶的浓度没有问题，应该加与组织等量的胶原酶消化，过多过少都不行。后面几步离心那些没有问题。还有我用的是DMEM:F12培养基加10%的胎牛血清。祝你成功。

作者: 都市青蛙 时间: 2012-12-12 20:26

你可以调整下消化时间，延长或者缩短，有时候总怕没有消化彻底就消化过了头，也会影响细胞量的

作者: 都市青蛙 时间: 2012-12-12 20:28

tangyihan 发表于 2012-10-30 09:28
3 L. s$ q( H6 [! W/ L回复都市青蛙的帖子
$ a4 ~& p9 C, ?3 p4 x6 p: u$ ^7 Y; y: Z; i3 I- |1 O7 v) E; L5 |
个人觉得胶原酶浓度也不是太重要，虽然文献上基本都用0.075%或者0.01%的胶原酶消化， ...

3 q4 G3 [3 q7 m7 H
配的浓度不一定必须一样，工作浓度合适就行，关键还是要掌握好消化程度和时间，不能机械地规定消化时间，还是要因材料灵活掌握消化状态和时间的

作者: danieldan08 时间: 2012-12-15 22:24

脂肪少了，最少3ML

作者: liyujuanmarry 时间: 2012-12-17 09:50

1、很可能是你的脂肪量太少，得到的细胞太少，如果细胞的接种密度过低，细胞间的相互作用就达不到细胞生长所需的水平
2、可适当延长消化时间，尽量将脂肪消化完全，以获得更多细胞
3、一般情况下，0.1%的I型胶原酶浓度应该是足够的了

作者: lcw918 时间: 2012-12-22 13:30

回复 loveless 的帖子

没有水浴箱？最好是在37°水浴箱里面摇荡，因为这个温度下酶的活性最好，效能最高，温度的改变对酶活性的影响，最终的作用效果可不是一两被的问题。再者，消化时间没必要完全按protocol的，你看消化成绒绒絮状，乳糜一样，就可以离心了

作者: loveless 时间: 2013-1-7 10:24

回复 liyujuanmarry 的帖子
3 ~3 B+ C! d& p- s8 ~ O. D% O
我想问一下，如果传代细胞数少的话，细胞还可以长满么？还是说就不长了，或是老化了呢？

作者: bin 时间: 2013-3-7 10:42

回复 tangyihan 的帖子- u1 N5 v$ G1 t& M# W! q, e

请问这个老兄，你有脂肪干细胞的培养nature protocol吗？

作者: s02260441 时间: 2013-3-7 13:54

回复 loveless 的帖子

这样肯定不到37度反应温度的，反应不完全取到的细胞量不会多啊。

作者: zhangjieyctc 时间: 2013-3-27 15:09

一般一型胶原酶，震荡15min就可以了，20ml脂肪提取的脂肪可以接种一个T75的瓶子

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)