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标题: 脂肪干细胞养不出来 [打印本页]

作者: loveless 时间: 2012-9-27 18:59 标题: 脂肪干细胞养不出来

养了快3个月细胞，可是还是没收获。实验步骤都是按以前师兄师姐做的，怎么就养不出来呢？还请各位指点一下9 K  m" j8 Y1 g" q7 r' Z# q
我的实验步骤：# x: K% {) I. b! U2 |6 j" B" p
  1、处死小鼠，75%酒精泡5min。
  2、无菌取腹股沟处脂肪，放入D-Hanks液中，反复冲洗。- E' N1 d  ?( z# w$ t. R, S; N
  3、剪碎组织块，呈半流质状，然后加到离心管中，加入1ml0.1%胶原酶，37℃，30min，不停的震荡。
  4、加入血清终止消化。离心，1300rpm，10min。$ I0 Q* {1 s$ @5 S3 q
  5、弃上清，加入2mlDMEM，离心，1000rpm，10min。
  6、弃上清，加入全培培养。
# n/ B% @: t8 p( T9 L
按这个步骤做了好久，没养出来，还请大家看看那个地方出问题了~~~谢谢！！

作者: amberma 时间: 2012-9-28 09:30

几号胶原酶？如果4号太温和了 30min 时间太短
试试胰酶10-15min c& b4 f, n! E

作者: loveless 时间: 2012-9-28 12:10

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我用的是I 型胶原酶，30min。

作者: willing 时间: 2012-9-28 20:33

是没有细胞长，还是什么情况？

作者: loveless 时间: 2012-9-29 09:15

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有细胞，但是很少，而且生长也很慢，原代十几天都不见长。

作者: 都市青蛙 时间: 2012-10-2 17:20

每次你能取到多少脂肪组织？; Y' \) N8 O# I! U6 M7 e. {
有没有留心胶原酶的作用浓度是否合适

作者: tangyihan 时间: 2012-10-3 09:38

回复 loveless 的帖子; `! k; {, y& `. l: {& a* h6 X( g
s) Y: U) J) Z* T" o& T! d- w
可以考虑:
1.用0.2%胶原酶。" s, s6 `$ ?7 B. w+ b1 \5 F) m
2.消化时间延长为1小时，这也是nature protocol上建议的消化时间。
3.离心后用100um filter 过滤。1 \- |) _. K( h, s- J+ b0 D* }
4.你应该把步骤些详细些:不停的震荡是什么意思？没见过protocol这么写的。" U$ [1 o& T0 L7 ^* x& M
5.发帖之前建议先看看其他帖子，园子里多着呢。7 g4 s/ L1 ^$ _) ~8 I
6 g0 B0 D0 p) n1 ?9 J( m
祝你成功！

作者: loveless 时间: 2012-10-3 14:27

回复都市青蛙的帖子+ U+ T1 d4 t* z* j
% `, j: ]. \; S" M: x P7 ^0 @
我用的是4~6周的小鼠，一只小鼠取到的脂肪很少，不到1ml。0.1%不合适？请问你是用多大浓度的？

作者: loveless 时间: 2012-10-3 14:31

回复 tangyihan 的帖子

请问你说的“消化时间延长为1小时”是指用0.1%的胶原酶还是0.2%的？“不停的震荡”就是用手一只晃，因为没有水浴振荡器，所以就人工震荡~~~~

作者: tangyihan 时间: 2012-10-5 09:42

回复 loveless 的帖子: ]! T: ^% b0 b1 r* ]
, h$ `+ x$ w# h* ~' Z
用0.2%的胶原酶消化

作者: meister 时间: 2012-10-9 15:30

回复 loveless 的帖子
& z4 Z& H% g6 e
不需要水浴振荡器，需要空气浴摇床。 37度，必须的，手晃不成。

作者: stemcellmeng 时间: 2012-10-11 14:06

这是比较标准的Protocol了，如果改进的话，应该是在消化完离心之后，过70um的筛网去除大块的细胞。理论上应该是有细胞的，可能是你取的组织太少了，下次可以尝试多取一些组织，而且一帮组织多的话，酶量也需要相应增加，一帮一只c57的小鼠取的脂肪，可以用5ml的胶原酶来进行消化。不知道你的培液是不是按照标准的MSC培养液来配置的，而且别忘了加双抗，防止污染。

作者: 都市青蛙 时间: 2012-10-17 20:47

loveless 发表于 2012-10-3 14:27
: a+ Y, ] ^- s4 u回复都市青蛙的帖子
5 ]) u4 Z5 q- w; |9 y6 ?( w) z6 d- d% }3 l3 {
我用的是4~6周的小鼠，一只小鼠取到的脂肪很少，不到1ml。0.1%不合适？请问你是用多 ...

+ ^' _" V- O% j) S! ]0 p
我取的也是1ml左右，要重点关心你的胶原酶作用浓度，这跟配比浓度有区别

作者: chengge21 时间: 2012-10-30 09:22

用胶原酶I放在摇床上，37°C消化，消化时间延长到一个小时。消化完后，要用吸管反复吹打几次（很关键），然后离心去除脂肪上清，加入完全培养基悬浮细胞，用200目滤网过滤。过滤完后离心，然后去掉上清，用培养基悬浮细胞，培养就行了。

作者: tangyihan 时间: 2012-10-30 09:28

回复都市青蛙的帖子, [( p% Y3 e2 S) u4 S( m

个人觉得胶原酶浓度也不是太重要，虽然文献上基本都用0.075%或者0.01%的胶原酶消化，但我每次消化时用0.2%的胶原酶也很好，2g大鼠脂肪组织可以取到10的5次方的细胞，觉得胶原酶溶液体积应该在脂肪组织体积的3至4倍的样子，充分与脂肪组织混匀才能消化彻底吧，如有不足之处还望各位指出...

作者: loveless 时间: 2012-11-3 10:28

回复 stemcellmeng 的帖子
# I6 _; {9 [9 V, W! ]2 R
我用的是Balb/c小鼠，胶原酶加1ml，因为脂肪量只有0.2ml。我的培养基是买的Hyclone的高糖培养基。

作者: loveless 时间: 2012-11-3 10:33

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胶原酶我也用过0.25%，但是还是没养出来。我用0.1%的养了人的脂肪干，方法步骤跟养小鼠的是一样的，就是脂肪量用了10ml，能养出来。可不知道为什么养小鼠的就是养不出来。

作者: xiaoyurly 时间: 2012-11-9 10:31

可以选择胖点的小鼠，周龄大一些对ADMSC活力影响不大，另延长消化时间到1h，原代铺盘时细胞密度一定要大，2d后即可换全液，一般3-4d可传代

作者: loveless 时间: 2012-11-9 19:52

回复 xiaoyurly 的帖子( G$ e- K7 p/ U. o" [$ I

周龄大小对ADSC没影响么？我用4~6周的balb/c很难养出来细胞，换成2天大小的SD乳鼠用同样的方法能养出来了，第2天就有好多贴壁的了。难道是balb/c小鼠脂肪干细胞少？: m5 [; \/ i/ }' |

作者: cartoonyang 时间: 2012-11-12 09:28

回复 loveless 的帖子6 \' z- e: t! ?3 }

1ml的量也太少了。消化时间延长到1小时，然后用枪头来回抽吸，再用100目筛过滤，再离心，再用培养液离心洗一遍即可。可以考虑48小时再换液。或者尝试用组织块培养法。

作者: loveless 时间: 2012-11-12 12:00

回复 cartoonyang 的帖子9 R4 ?/ \ e5 V- e6 Y" f0 C# g" m

balb/c的用组织块贴壁法也没养出来，SD乳鼠组织块能养出来，不知道是为什么。2 @0 `) p' j6 d9 C2 @* m

作者: xiaoyurly 时间: 2012-11-12 16:43

回复 loveless 的帖子( F9 F, {$ e: W. r

我们实验室一直都用25-30g的雄性C57小鼠来提ADSC，周龄至少在9周以上，2只得到的细胞可铺一个10cm dish，长得很快，而且很纯，一般4-5天可传代，而后2天传代一次。用周龄小的小鼠获得的细胞数较少，需要4-6只才能获得一盘原代，就我们观察细胞活性基本没有区别。balb/c小鼠没有用过，不太清楚。我们的经验就是ADSC一定要密铺快传，这样细胞活力保持的比较好，否则容易老化，另外要用比较好的血清，我们用alphaMEM培养基，20% FBS。

作者: loveless 时间: 2012-11-15 15:27

回复 xiaoyurly 的帖子 E7 p3 K! M$ z. T3 K0 ?- M

密铺快传？要是快的话，细胞还没长到80%。我原代的时候按1:1原瓶传的，P1第2天还感觉挺好的，就是数量不多，想让细胞长到80%传代，结果第4天就老化了~~

作者: sunflower636 时间: 2012-12-3 21:51

回复 loveless 的帖子6 v0 r5 g1 E9 M! r( Z( ?: L! o
% t6 A: g n! t. d
我也摸索了几个月才摸索出来，但是我不是做老鼠的。细胞少可能是因为你的标本量太少，另外胶原酶的浓度没有问题，应该加与组织等量的胶原酶消化，过多过少都不行。后面几步离心那些没有问题。还有我用的是DMEM:F12培养基加10%的胎牛血清。祝你成功。

作者: 都市青蛙 时间: 2012-12-12 20:26

你可以调整下消化时间，延长或者缩短，有时候总怕没有消化彻底就消化过了头，也会影响细胞量的

作者: 都市青蛙 时间: 2012-12-12 20:28

tangyihan 发表于 2012-10-30 09:28 ; Y7 g' U, J9 G( J  b7 ~
回复都市青蛙的帖子2 z9 q7 }  R$ k5 e5 p* T1 C

+ Z& J8 M( C: \  r& E2 A个人觉得胶原酶浓度也不是太重要，虽然文献上基本都用0.075%或者0.01%的胶原酶消化， ...

' t) [" Y1 k3 s
配的浓度不一定必须一样，工作浓度合适就行，关键还是要掌握好消化程度和时间，不能机械地规定消化时间，还是要因材料灵活掌握消化状态和时间的

作者: danieldan08 时间: 2012-12-15 22:24

脂肪少了，最少3ML

作者: liyujuanmarry 时间: 2012-12-17 09:50

1、很可能是你的脂肪量太少，得到的细胞太少，如果细胞的接种密度过低，细胞间的相互作用就达不到细胞生长所需的水平, j2 Z. r3 {$ K3 ~2 @
2、可适当延长消化时间，尽量将脂肪消化完全，以获得更多细胞, i- E: S7 {4 |% y/ I4 H. x
3、一般情况下，0.1%的I型胶原酶浓度应该是足够的了

作者: lcw918 时间: 2012-12-22 13:30

回复 loveless 的帖子* m& n; x4 I; d: ^$ i: J2 D

没有水浴箱？最好是在37°水浴箱里面摇荡，因为这个温度下酶的活性最好，效能最高，温度的改变对酶活性的影响，最终的作用效果可不是一两被的问题。再者，消化时间没必要完全按protocol的，你看消化成绒绒絮状，乳糜一样，就可以离心了

作者: loveless 时间: 2013-1-7 10:24

回复 liyujuanmarry 的帖子
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我想问一下，如果传代细胞数少的话，细胞还可以长满么？还是说就不长了，或是老化了呢？

作者: bin 时间: 2013-3-7 10:42

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请问这个老兄，你有脂肪干细胞的培养nature protocol吗？

作者: s02260441 时间: 2013-3-7 13:54

回复 loveless 的帖子* s% ]2 H* k1 r+ n4 g

这样肯定不到37度反应温度的，反应不完全取到的细胞量不会多啊。

作者: zhangjieyctc 时间: 2013-3-27 15:09

一般一型胶原酶，震荡15min就可以了，20ml脂肪提取的脂肪可以接种一个T75的瓶子

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