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标题: 请教一个关于PCR的问题，急！ [打印本页]

作者: ind6562 时间: 2012-10-5 18:27 标题: 请教一个关于PCR的问题，急！

由于我的细胞处理时间已到，现在必须提mRNA了，但因为这几天放假我们实验室逆转录的设备还不能用，要等几天。我知道mRNA很容易降解，提取之后最好立即进行逆转录，但目前条件还不允许逆转录，大家有什么办法能让我把mRNA提取出来还能保存一段时间呢？" Z }; E' S" |, T7 ]
我听说可以用Trizol裂解细胞后放负80度保存就可以，等有条件了再取出进行接下来提取mRNA的步骤，这个方法效果好吗？& `+ g, k+ j7 F. _
谢谢各位大侠！

作者: jennyshizz 时间: 2012-10-5 20:34

这个方法可以，我实验室之前有师姐直接将细胞放在trizol然后置于-20保存的，一个月都没问题；我做实验的时候就是把RNA提取出来之后直接放在-80冻着，之后要反转录的时候再拿出来用，效果也都不错，只要动作迅速，操作过程中用DEPC水处理过的器具就ok了。

作者: jensn 时间: 2012-10-5 22:00

做逆转录需要特殊的设备吗？现在商用的试剂盒加上PCR仪就可以完成逆转录实验啊。至于你提到的放在-80度冰箱保存，短时间内问题是不大的，但是做mRNA的困难之处最主要在于防止你实验过程和环境中的RNA酶，因此，你需要对你所使用的任何器具和试剂进行除RNA酶，这点我觉得更关键。

作者: weiyepan 时间: 2012-10-5 22:45

细胞吸干了培养液直接整盘放-80度，要抽RNA的时候拿出来抽就行了。。。

作者: ind6562 时间: 2012-10-6 14:10

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请问这样直接冻住细胞它们拿出来的时候还是贴壁着吗？

作者: lxm5668 时间: 2012-10-6 14:37

楼上jensn说的有道理，逆转录不需要什么专用的设备，你把试剂和逆转录试剂盒准备好就行了。如果没有准备好的话，细胞处理时间到了就马上终止培养，按照收取完整细胞的方法，轻柔的挂下细胞，用PBS洗两遍，离心转速要轻柔，800g, 2min, 以保证细胞的完整，将PBS 吸除干净，将细胞直接冻存在-80度冰箱，先不要加Trizol裂解细胞。等条件准备好了再加入Trizol裂解细胞，所用的所有物品都是DEPC水处理过的。

作者: huangcong1988 时间: 2012-10-7 21:25

提细胞RNA还是很简单的，用trizol提的话，您可以先用trizol裂解细胞，收集到用DEPC水处理过的离心管中，然后低温保存细胞。7 V9 s6 N W" p, s0 i8 Z: J0 a
之后要再提的话，直接先4度融化了，然后提就是，trizol本身就有防止RNA降解的功能（trizol跟DEPC水的作用类似，都是抑制RNA酶活性）
做反转录的话，貌似不需要什么专业设备吧？一个超净台就OK了，还有就是反转录试剂盒
你提的RNA直接放在负80就可以了，建议最好分装，因为反复冻融会促使RNA降解，RNA放在负80，能放很久，大概一年以后的我也用过，不过最好是现提现反转录，但是负80放一两个月再反转录还是没有问题的

作者: weiyepan 时间: 2012-10-11 02:36

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贴壁的妥妥的，用的时候用PBS吹下来或者直接刮下来，再离下心就行了。

作者: prophe 时间: 2012-11-2 13:11

我们实验室试过，Trizol裂解细胞后放负80度保存一个月都可以的，mRNA在Trizol裂解液中比较稳定，即使提取mRNA后负80度保存几天都没问题的。

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