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标题: 请帮我看看养的干细胞是不是老化了？还是污染了？谢谢 [打印本页]

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作者: bty007    时间: 2012-10-20 00:09     标题: 请帮我看看养的干细胞是不是老化了？还是污染了？谢谢


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我养的小鼠干细胞才传到第三代，感觉细胞就不太好了，是污染了吗？( i7 W: `8 p' i# m8 n% H
图里面发白的那种圆圈是什么？
  x2 _; N2 z! _( C& S- U应该不是死细胞吧？好像不动。。冲不掉。。。
# Z1 L3 D& R9 \2 w4 W是不是胰酶消化时间过长细胞易老化？我消化了四分钟吧: P0 j% |3 `  \

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上面是小鼠颌骨骨髓间充质干细胞第3代
8 H1 Z+ a$ f' ~下面一张是小鼠髂骨第三代的，长得形状也好奇怪- Q: z5 L" i$ {0 E6 E0 l$ z/ z

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作者: 若兰汀    时间: 2012-10-20 00:36

我养过小鼠骨髓间充质干细胞，小鼠来源的细胞并不像大鼠或者人来源的间充质细胞一样有典型的梭状细胞形态，我看你颌骨的那张单从形态上来看和我的很像（我买的商品化的细胞株），应该没问题，但是那个髂骨的我就说不好了，小鼠的细胞挺难建系的，很难纯化干净。另外那个亮点你不用在意，不是污染，我养的时候也会这样，一般细胞状态不错的时候才会有，而且这个也与你拍照时使用的光圈强度有关。不同品系的小鼠的细胞质量相差很大，C57就比Balb/c活力强很多，我的经验是，老鼠的生命力越顽强，分离的细胞也越好。祝你实验顺利！

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作者: 若兰汀    时间: 2012-10-20 00:39

另外，建议你买商品化的小鼠间充质培养基，还有每次换液的时候半量换液或1/3比例换液，传代时不宜过稀，细胞长得会整齐一点，而且形态也好看一些。

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作者: liuyul03    时间: 2012-10-20 21:00

个人感觉细胞老化还是很明显的，另外图中发白的圆圈在我的其他动物BMSCs培养中也有见到，我觉得是细胞，发亮，圆形或椭圆形，两端有细丝，想请教高人，是否是自发分化为神经细胞啊

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作者: bty007    时间: 2012-10-20 21:19

回复 若兰汀 的帖子. z7 u4 s' B7 s" ^- p* }2 z5 k* i
5 u: ]% R% P, I( B1 f1 B) O
非常感谢哈~~听到这样说我就放心了，准备做检测呢，发现传代后细胞跟原代相差好大，都有点不敢做了

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作者: bty007    时间: 2012-10-20 21:25

回复 若兰汀 的帖子
4 C9 J* z" t+ l- L, H- ~
9 q. d& `  F5 {1 r/ D嗯。。我只有原代24h后是半量换液，之后就都是全量换了，有时看到还有好多死细胞漂的时候就PBS冲下，细胞贴壁挺紧的，冲下没关系吧，不用冲的话自己感觉细胞容易污染，也不知道对不对？

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作者: bty007    时间: 2012-10-20 21:28

回复 liuyul03 的帖子, ^/ o5 q4 m9 h( Q- U3 \; s
' I3 C0 z7 H3 K9 Y
我就是奇怪为什么才3代细胞就老了。。。有必要加生长因子吗？; ]3 y5 k0 e+ f
发亮的有可能是混进去的杂细胞吗？我看的时候是发现亮的越来越多，就有点担心是什么污染混进去了

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作者: 若兰汀    时间: 2012-10-21 00:35

回复 bty007 的帖子
9 v% H: c# Z* S5 Y- w) S
9 h; p, E9 I3 F5 G有条件的话用DMEM：F12冲洗吧，我买的商品化的培养基套装，kit里面就配有L-谷氨酰胺。

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作者: Donnies    时间: 2012-11-1 10:40

应该是细胞老化了，细胞老化的话，形态也会出现很大的变化，而且很容易消化，但是如果你消化下来再进行传代的话，细胞基本上就挂了，如果是污染的话，你在显微镜下会明显看到细胞的表面漂浮着一层东西

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作者: bty007    时间: 2012-11-3 19:38

回复 Donnies 的帖子
, Q% H. @! M! e
/ {3 ^' ?+ D9 Z, K7 d5 q谢谢。5 T( e6 K- z& \
后来看貌似细胞恢复了点形态，有点儿立体的感觉了。。之后又传了2代，目前细胞还好，倒没有污染的浑浊的迹象，就是还会有圆圈的贴壁挺紧的细胞。。
2 `$ w8 i1 ]( ]2 c想想可能跟我中途换培养液有关，开始养细胞用的是国产的DMEM，后来换成Hyclone的了，可能是细胞不适应的关系才长不太好了

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作者: cuizhuzhu    时间: 2012-11-4 15:07

回复 bty007 的帖子
7 ^& |5 O4 a6 Y( w) E/ H7 r0 N+ ~' N0 Q' T9 b" e
能分享一下你是怎么养的吗!我最近也在养郁闷死了，细胞一传代就死完了！单纯用胰酶能消化下来？不是要加EDTA吗？

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作者: Donnies    时间: 2012-11-5 08:54

回复 bty007 的帖子
; `- B* e( x# g: [. @7 {$ D" w; a  O
我们一直用的是Hyclone的，便宜而且还可以，细胞培养主要是血清，基础培养基的话差别不是很大

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作者: rhmm    时间: 2012-11-14 22:23

应该是死细胞吧或者杂质，我曾经养过神经干细胞和脂肪干细胞，也是像你这种情形，而且如果真是污染的话上清液早期倒置显微镜下应该可以看到发黑的渣滓样的东西，很密集，晚期会很浑浊！多养几次就有经验了

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作者: loveless    时间: 2012-11-14 22:39

回复 bty007 的帖子
* K( H& `& T# `0 M3 M: m! |+ \2 V# e
楼主的细胞鉴定出来是间充干么？我养的也是这个样子，说是老化了，就给扔了······可是现在养的P1代好像也很像这个样子的，有点怕怕的~~~~

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作者: bty007    时间: 2012-11-15 22:01

cuizhuzhu 发表于 2012-11-4 15:07
, V+ }+ I) _9 Q* l2 }3 t/ w回复 bty007 的帖子
# K. F2 v$ E3 _- }
5 n  P$ }! j0 i5 W' |能分享一下你是怎么养的吗!我最近也在养郁闷死了，细胞一传代就死完了！单纯用胰酶能消 ...

# O5 V5 M4 H: l  A$ v. K
我用的是骨片培养法，取骨剪碎再胶原酶37度消化1小时，离心培养骨片的。5 p" }6 L5 p* V* t  ]- _: l5 U
细胞传代还是能增值的挺快的，就是纯不纯不好说了，细胞形态差别多，也不确定是不是一种细胞。
5 [, d9 C) O) q2 ]5 s% [: _只用胰酶也可以消化的，干细胞对EDTA很敏感，用加它的胰酶消化细胞一定要离心，把EDTA去干净，否则对细胞不太好。

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作者: bty007    时间: 2012-11-15 22:04

rhmm 发表于 2012-11-14 22:23
. D& w2 r( }+ `" i6 T0 O6 ~' k" w应该是死细胞吧或者杂质，我曾经养过神经干细胞和脂肪干细胞，也是像你这种情形，而且如果真是污染的话上清 ...

& ^: o$ M, z2 g$ h& Y
不清楚是什么细胞，说是死细胞吧它却不漂。。贴的挺紧，而且貌似有增多的可能，但培养液却没有浑浊，应该不是污染吧，不知道是不是养出来的杂细胞

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作者: bty007    时间: 2012-11-15 22:13

loveless 发表于 2012-11-14 22:39
1 p" B( s( h/ o# F) v9 N回复 bty007 的帖子* W* c5 L4 [3 _1 o' u4 O) U6 g
9 s) o( m. h) Y2 z; b3 g; B
楼主的细胞鉴定出来是间充干么？我养的也是这个样子，说是老化了，就给扔了····· ...

- k+ u' V6 B4 R( n; |$ F6 H
我还没有做鉴定，正在考虑怎么鉴定好，之前养的到p5 p6就老的不行了，不知道哪里做的不好。。。准备重新养到二三代就鉴定。0 k3 O' q, r9 k# g# R
我的P1应该还好吧，不知道图能不能看的到：[attach]47535[/attach]

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作者: bty007    时间: 2012-11-15 22:44

偶的细胞P5 p6代 没加什么因子什么的。。不知道是老的不成样子了。。还是自然分化了。。长得奇奇怪怪的。。求指教。。' d0 z# K# a/ F" a$ q5 ^
# q( M8 W% X! o( u
9 f! O: t! }9 n0 ~9 B
[attach]47536[/attach][attach]47537[/attach]

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作者: caiyu07248    时间: 2012-11-16 09:16

回复 bty007 的帖子6 u6 H: y. A. _0 K. ]8 u# R. N0 w$ H( p

) b' c8 ]7 [2 f% R我的经验，我用血清养的话，基本上养到P5,p6细胞就有分化的状态了，因为血清会促进细胞分化，血清浓度越高，细胞越是容易分化。用无血清培养基传的代次能够久一点。

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作者: zb_ming    时间: 2012-11-16 09:59

亮的一般是杂质或细胞碎片，不是污染，对细胞影响不明显，不必在意。细胞培养中常见这种现象。

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作者: loveless    时间: 2012-11-16 10:25

回复 bty007 的帖子8 _/ z5 I- ^; d8 w0 k. g5 M8 R

  s: [! q6 L9 R, K. k) L你这个P1养了几天了？有没有加生长因子？我的P1刚贴壁的时候也是这样的，但是细胞数太少不能传代，长几天以后又开始老化~~

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作者: ditiger    时间: 2012-11-16 12:48

建议用年轻鼠做，分出的细胞老化程度与年龄关系密切~

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作者: 干细胞狂想    时间: 2012-11-16 13:04

这么多人回复过了~ 呵呵，我养间充质快2年了，告诉你一点经验吧~ 你这个细胞没有被污染，途中圆圆亮亮的要么是快死的细胞皱缩，就是细胞触角没有贴，有点浮，这个现象在你用PBS洗后会更明显，下次你换液时可以显微镜下观察观察~ 然后你的细胞状态不好，你说才第三代，我看着像8代以上的细胞，所以推测你在传代操作过程中对细胞的机械损伤或者是胰酶消化时间没有掌握好~ 另外，很重要的一点，我想告诉大家，间充质并不是一定是长梭形，也有可能是多变型，这与细胞的培养环境是有关的~ 只不过在目前的培养液中大部分都是看到的长梭形~ 但这个也与培养液有关，比如血清来源，血清比例，培养液配置时间等~　多看看文章就知道了～～～

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作者: deshenglll    时间: 2012-11-16 16:12

应该不是污染，主要是细胞形态不是太好啊。

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作者: bty007    时间: 2012-11-17 21:21

loveless 发表于 2012-11-16 10:25 - N. s, \* {2 g; A% B
回复 bty007 的帖子
" h0 X- {# G$ q7 f& j7 I' H' t
5 e  k7 c, L/ E: `" L; `4 |你这个P1养了几天了？有没有加生长因子？我的P1刚贴壁的时候也是这样的，但是细胞数太 ...

) S  l6 n+ U% o3 [3 E5 M2 b; a呀不好意思，我对时间的时候发现17楼传的那张不是P1的，是P0第9天，我消化了换瓶养、打散细胞前拍的（原代长得不分散，有的地方很挤，有的地方很空）。
' z1 |  |. L+ {0 z: i/ v8 o
; D3 f: g# A' y: C% Q) M% \消化了之后应该就是P1了吧，- d+ M  q* |; z4 }8 {$ f$ X! _/ T
这是P1第二天：' S) y1 Z3 t& |9 O" w: d0 Q4 `
[attach]47594[/attach]) U( V  \. {# N) V" ~

8 l2 x. l/ N0 k2 |这些是P1第六天拍的：2 f9 D6 k9 i8 j2 ~" k" z8 R# r# ^
[attach]47593[/attach]
: y1 Y1 ]2 H5 Z0 u% M$ Q5 Q8 L[attach]47592[/attach]
1 ^7 u! {7 `# n; H4 l- F$ i+ B5 e

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作者: bty007    时间: 2012-11-17 21:24

ditiger 发表于 2012-11-16 12:48 & |, s: V- N/ _& \
建议用年轻鼠做，分出的细胞老化程度与年龄关系密切~

0 j$ Q) e. k" F嗯，我现在用的是3-4周龄的，有时觉得4-6周也好

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作者: bty007    时间: 2012-11-17 21:28

干细胞狂想 发表于 2012-11-16 13:04 * n  I( ?; N+ K7 m8 C$ V
这么多人回复过了~ 呵呵，我养间充质快2年了，告诉你一点经验吧~ 你这个细胞没有被污染，途中圆圆亮亮的要么 ...

" \# m' i$ n; R+ v6 d5 ~, p
谢谢哈~我也感觉3代的看着像八九代的。。。估计是操作问题吧。。正在重新养细胞。。
" o3 E3 l5 \2 V) H/ J我想问下这样提出来的细胞能直接做后续检测吗？比如说成骨诱导。。还是要提纯下细胞再做？不提纯做出的结果可信吗？
0 i! w" }$ V# j: f还有流式分选后的细胞据说状态不太好，基本不能用了，有什么比较好的提纯方法吗？求指教，谢谢

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作者: bllx58    时间: 2012-11-18 12:32

我们实验室也做MSC+ T' b1 C* H( d3 O- @9 b4 m1 P

. w8 f9 P7 k) z- K# k' U! m! P6 C- _楼主的细胞老化得很严重，建议不要再养下去
) k& ]4 A5 K) M: y  d6 H0 {
  H3 G7 ~% A6 x0 h推荐Hyclone的培养基，效果不错

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作者: rhmm    时间: 2012-12-30 23:09

回复 bty007 的帖子
* Q" {  X) v* a/ f2 D9 {
8 d/ u2 ^1 _5 ^. P. P8 G( d感觉你的细胞活性不是很好，胰酶使用也是很关键的，我个人体会，对于神经干细胞还是用Hyclone的，脂肪干细胞要用Gibico的，而且用量和消化时间要根据你取材的量而变化，不能照本宣科。有时候文献报道出来的是一回事，你要慢慢摸索出自己的一套方法。

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作者: wangxiaowei0917    时间: 2012-12-31 17:20

其实你这个细胞应该是因为老化代数高了，或者是因为你没有很好的维持住他的干性，导致一定程度的分化了。白点不是污染。

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作者: 李兰兰    时间: 2013-1-17 22:08

回复 若兰汀 的帖子& T8 X" C' e! [9 B" M3 x
) U9 E9 k8 w) h" b
请问有商品化的大鼠间充质培养基么？小鼠的你用过么？效果怎样？是什么品牌？
5 F3 [0 l5 c+ ^) E2 M刚做实验，请多多指教

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作者: 天天天雨雨    时间: 2013-1-22 09:04

这个细胞老化很严重，那个亮点是死细胞

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作者: 倒腾细胞    时间: 2015-1-3 16:20

回复 干细胞狂想 的帖子
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赞      

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作者: 倒腾细胞    时间: 2015-1-3 16:25

每次污染都是真菌污染   这是为什么呢？  另外有同志用“三抗”吗？据说可以抗真菌~

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作者: 干细胞狂想    时间: 2015-1-7 09:34

真菌污染，加点 两性霉素B

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作者: yuanyecat    时间: 2015-1-7 10:39

污染不是这样的，不用担心，可能活力不强，但是绝不是污染

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作者: wuhuaguo88l    时间: 2015-8-26 07:45

看上细胞的形态都不明显了，第一次见。

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