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标题:
请教，为什么我用碱裂解法大提的质粒电泳只有两条带？
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作者:
yuhaoze
时间:
2012-10-24 16:49
标题:
请教，为什么我用碱裂解法大提的质粒电泳只有两条带？
今天用碱裂解法大提的质粒，跑电泳出来了两条带，想问一下，正常情况下不是三条带吗？
: ?. L( l* L" s2 h4 u$ [1 }' x
在就是A260/A280=2.3,会影响转染效率吗？
作者:
碧落
时间:
2012-10-24 17:42
据说，比较好的情况是三条带，一般两条带也就是可以的了。
作者:
xulijunji
时间:
2012-10-24 20:25
我做的时候两条或者三天都表明比较纯的，至于转染。。。没做过，不过我当时做转化没问题的
作者:
yuhaoze
时间:
2012-10-24 21:13
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xulijunji
的帖子
2 X9 D1 [ M) f$ Y" v6 L" W
& ?" Z# m% N& d: c
做转化对质粒的要求可能比转染要低一些...
作者:
weiyepan
时间:
2012-10-24 21:47
做得最好的是一条带——都是超螺旋。。。你跑的这带型有点奇怪，建议做个酶切看看。
作者:
sanna1
时间:
2012-10-24 22:29
没切的质粒跑出来的电泳图不是一条带吗？为什么会有两条，三条的问题?
! I9 L6 \ r8 b
能解释一下吗？
作者:
rexhz
时间:
2012-10-24 23:44
做转染最好用试剂盒提，而且是去内毒素的那种。手提里面有很多RNA
作者:
86964109
时间:
2012-10-25 08:06
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sanna1
的帖子
5 G) L5 u$ M2 w' z5 d) r; n
$ }6 ^8 X7 z% \$ {9 Z: U
因为有超螺旋，线性、和缺刻3种质粒形式，他们的电泳速度不一样，线性跑得最慢好像，
; c' x& o) \4 t1 w. [
所以...
0 V: n3 s- Y- x9 [! h
; M% l1 H" ?6 Q/ A. O7 [/ N5 k" u
补充内容 (2012-10-25 08:09):
) H3 N2 W$ I0 H- R4 t
如果是瞬转,建议环形质粒转染,因为环形质粒更容易进入细胞,这样可以提高转染后阳性率.
1 }$ d3 O, D$ p& p1 V
有人说的：如果是挑稳转,建议线性化以后转,因为稳转不要求转染效率,线性化的质粒更容易整合到细胞的基因组中,这样可以提高克隆
作者:
zxcv12345
时间:
2012-10-25 08:20
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yuhaoze
的帖子
/ o. l9 P" z' n# z. S$ x- U
1 S( i5 R$ H3 P! I* }. }9 x( ~
转染纯度要求高，最好要用试剂盒提取质粒
/ C' c, G% ^. k) t
提取后的最好为超螺旋，也就是一条带
作者:
yuhaoze
时间:
2012-10-25 08:48
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86964109
的帖子
k$ i& K4 c" V+ Y: P# ^3 E1 i
8 Q% J6 {) B2 P& m
碱裂解法提不出线性的DNA
作者:
yuhaoze
时间:
2012-10-25 08:51
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sanna1
的帖子
. I; n8 a+ K J. }0 i, I' i
' ?- J# W7 q. w4 \7 q
超螺旋，开环，中间体
作者:
yuhaoze
时间:
2012-10-25 08:52
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rexhz
的帖子
- |, E9 t1 n* s% H) F% M4 B
2 j: y; i2 f7 C( G# W
是啊，不过手提步骤超多，有很多除RNA的步骤，最后还是除不净？
/ I6 f* \( T, o" |9 G9 r
作者:
86964109
时间:
2012-10-25 08:53
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yuhaoze
的帖子
: h( k8 Y) t/ u% W
8 w7 l& b p' k7 C; T: F
可以再做单酶切
作者:
第一心音
时间:
2012-10-25 17:32
恭喜你，你提出来了，可以用。
作者:
pipi168
时间:
2012-10-25 17:43
一般就是2条带
作者:
yuhaoze
时间:
2012-10-25 18:20
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pipi168
的帖子
9 {/ s& B! v& k
2 F G+ _+ {" `& s0 h2 M* e! ]
我想问问您这两条带分别是什么，因为酶切之后只剩一条了
作者:
huangcong1988
时间:
2012-10-26 10:45
两条带，也没问题，你要做个酶切鉴定，而且还要测序，鉴定正确了，就没问题，可以用
作者:
pipi168
时间:
2012-10-26 14:16
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yuhaoze
的帖子
* P2 k& r* G& W4 x
: Z* Q. M1 ~4 c5 r
要签订以下的
作者:
vividvivid1225
时间:
2012-11-13 13:05
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碧落
的帖子
! N% n1 i ~6 o
" B W( l X! Q& \& t
好的情况为啥2条或者3条呢？最好的情况不应该是只有一条带，超螺旋吗？
作者:
碧落
时间:
2012-11-22 21:33
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yuhaoze
的帖子
( t" a# f# k( G. w# n& \7 i! [
. j$ w3 A: S* O8 [) {& q
应该有一条是大肠杆菌的自身的DNA吧
作者:
碧落
时间:
2012-11-22 21:34
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vividvivid1225
的帖子
/ O- @& o( S2 ~1 h. }
5 \. v& Z4 H u; x* i
应该有一条是大肠杆菌的自身的DNA吧
作者:
袁小懒
时间:
2012-11-22 21:41
一般都是一条带，但有时候两条带也是很正常的，因为是质粒嘛，有正常环装还会有超螺旋等不同形态，而因为它们的形态不同，在电泳过程中跑的速度不同纠纷出两条带了:)
作者:
vividvivid1225
时间:
2012-11-23 09:44
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碧落
的帖子
# ]9 u! {9 G$ R& ]/ D
" E3 U1 |3 ?2 g3 E/ L& l, l
大肠杆菌的基因组是线性的，碱裂解法用到NaOH。碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理时变性的DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA和染色体DNA分开。所以碱裂解法是提不出线性DNA的。
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