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标题: 请教，为什么我用碱裂解法大提的质粒电泳只有两条带？ [打印本页]

作者: yuhaoze 时间: 2012-10-24 16:49 标题: 请教，为什么我用碱裂解法大提的质粒电泳只有两条带？

今天用碱裂解法大提的质粒，跑电泳出来了两条带，想问一下，正常情况下不是三条带吗？
在就是A260/A280=2.3,会影响转染效率吗？

作者: 碧落 时间: 2012-10-24 17:42

据说，比较好的情况是三条带，一般两条带也就是可以的了。

作者: xulijunji 时间: 2012-10-24 20:25

我做的时候两条或者三天都表明比较纯的，至于转染。。。没做过，不过我当时做转化没问题的

作者: yuhaoze 时间: 2012-10-24 21:13

回复 xulijunji 的帖子: C; z! M2 G% k& ?% E0 @
1 f( i) }! |& T
做转化对质粒的要求可能比转染要低一些...

作者: weiyepan 时间: 2012-10-24 21:47

做得最好的是一条带——都是超螺旋。。。你跑的这带型有点奇怪，建议做个酶切看看。

作者: sanna1 时间: 2012-10-24 22:29

没切的质粒跑出来的电泳图不是一条带吗？为什么会有两条，三条的问题?0 f7 [! s9 Z9 Y9 [/ w
能解释一下吗？

作者: rexhz 时间: 2012-10-24 23:44

做转染最好用试剂盒提，而且是去内毒素的那种。手提里面有很多RNA

作者: 86964109 时间: 2012-10-25 08:06

回复 sanna1 的帖子1 F$ n5 x; o: a$ o P
; e! q! h$ _6 ~! Y/ ?
因为有超螺旋，线性、和缺刻3种质粒形式，他们的电泳速度不一样，线性跑得最慢好像，- A4 |) `' g- `3 }! }0 C
所以...

补充内容 (2012-10-25 08:09):
如果是瞬转,建议环形质粒转染,因为环形质粒更容易进入细胞,这样可以提高转染后阳性率.
有人说的：如果是挑稳转,建议线性化以后转,因为稳转不要求转染效率,线性化的质粒更容易整合到细胞的基因组中,这样可以提高克隆

作者: zxcv12345 时间: 2012-10-25 08:20

回复 yuhaoze 的帖子2 D4 L0 G; t; P4 ]

转染纯度要求高，最好要用试剂盒提取质粒% T. f9 I! c; j5 k7 J
提取后的最好为超螺旋，也就是一条带

作者: yuhaoze 时间: 2012-10-25 08:48

回复 86964109 的帖子% [! _8 x$ o2 `# ~8 t

碱裂解法提不出线性的DNA

作者: yuhaoze 时间: 2012-10-25 08:51

回复 sanna1 的帖子; W# m8 R! g4 e# k O" N' l- Y
. [: G/ T& f% ]* L
超螺旋，开环，中间体

作者: yuhaoze 时间: 2012-10-25 08:52

回复 rexhz 的帖子

是啊，不过手提步骤超多，有很多除RNA的步骤，最后还是除不净？" V3 g7 N! b2 ]. o" J* ^ \

作者: 86964109 时间: 2012-10-25 08:53

回复 yuhaoze 的帖子7 s1 ^7 m. k) {; ^
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可以再做单酶切

作者: 第一心音 时间: 2012-10-25 17:32

恭喜你，你提出来了，可以用。

作者: pipi168 时间: 2012-10-25 17:43

一般就是2条带

作者: yuhaoze 时间: 2012-10-25 18:20

回复 pipi168 的帖子

我想问问您这两条带分别是什么，因为酶切之后只剩一条了

作者: huangcong1988 时间: 2012-10-26 10:45

两条带，也没问题，你要做个酶切鉴定，而且还要测序，鉴定正确了，就没问题，可以用

作者: pipi168 时间: 2012-10-26 14:16

回复 yuhaoze 的帖子5 Q* K- ^, D* \) v. t5 D

要签订以下的

作者: vividvivid1225 时间: 2012-11-13 13:05

回复碧落的帖子! c- ]8 J, P4 {4 V$ b- N5 u0 G. B

好的情况为啥2条或者3条呢？最好的情况不应该是只有一条带，超螺旋吗？

作者: 碧落 时间: 2012-11-22 21:33

回复 yuhaoze 的帖子& Z$ b) O% l! D- H
% t. a- ?8 k! d8 A4 [
应该有一条是大肠杆菌的自身的DNA吧

作者: 碧落 时间: 2012-11-22 21:34

回复 vividvivid1225 的帖子

应该有一条是大肠杆菌的自身的DNA吧

作者: 袁小懒 时间: 2012-11-22 21:41

一般都是一条带，但有时候两条带也是很正常的，因为是质粒嘛，有正常环装还会有超螺旋等不同形态，而因为它们的形态不同，在电泳过程中跑的速度不同纠纷出两条带了:)

作者: vividvivid1225 时间: 2012-11-23 09:44

回复碧落的帖子( W7 ^; j; ^* {, ~# `$ t% k
/ r) H9 g" _1 O2 g( R* O. x+ N. |
大肠杆菌的基因组是线性的，碱裂解法用到NaOH。碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理时变性的DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA和染色体DNA分开。所以碱裂解法是提不出线性DNA的。

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