干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 求助关于大鼠骨髓间充质干细胞分离培养 [打印本页]

作者: chengge21 时间: 2012-10-26 10:56 标题: 求助关于大鼠骨髓间充质干细胞分离培养

本人新手，提取了几次大鼠间充质干细胞，所用方法大体如下：1.将SD 大鼠断颈处死，浸于75％的酒精中5 min。
2.无菌取双下肢并剪去皮毛，剔除股骨、胫骨周围肌肉组织等，再用灭菌的PBS 反复冲洗。) s! A& @3 u8 n. ]; }* D) N
3.剪去骨的两端，暴露髓腔，用1ml注射器针头穿刺两侧骨端，用含10％胎牛血清的DMEM培养基冲出骨髓，用1ml注射器针头反复吹打。
4.置于10 ml 离心管中，1 000 r ／ min 离心5 min，弃上清。
5.再用含10％胎牛血清的DMEM培养基反复吹打，重悬细胞。* A+ ^7 w( B0 F
6.接种于培养皿中，于37℃，5％ CO2，饱和湿度的培养箱中培养，24h后更换培养液，弃去未贴壁细胞，此后每3 d 换液1 次，细胞长至90％汇合后，用0. 25％胰酶消化，传代。用这种方法提取出来的细胞，24小时后贴壁的很少，而且长势非常慢，细胞形态也不好，提取几次都是这样，请大家指点一下。

作者: wujh1986 时间: 2012-10-26 12:16

全骨髓培养就是这样子的,杂细胞会比较多,你可以把骨髓冲洗下来后,密度梯度离心,分出单个核细胞,再去培养,不要24小时就换液,前两天不要总是拿出来看,三四天后半量换液就可以了啊

作者: live861215 时间: 2012-10-26 13:17

回复 chengge21 的帖子

建议你第二步用DMEM培养基冲洗，这样能使细胞处于一种有营养的状态，用PBS冲洗，可能会对细胞有影响，你可以试试。我培养全骨髓时，也遇到了和你一样的情况，细胞不仅贴壁的少，而且长得慢。

作者: 张贺吉 时间: 2012-10-26 14:47

离心速度有点低，我用1500rpm，好像好些

作者: xiangsi414 时间: 2012-10-29 20:53

吹打的过程要注意，尽量轻柔，避免机械损伤造成的细胞死亡，本来小鼠骨髓中能提出的间充质干细胞就是很少的！

作者: sysuhoo 时间: 2012-10-29 21:12

就个人经验来看，吹打力度和离心速率对细胞的影响不是很大，楼主细胞的情况应该比较符合二楼所述，另外最好在冰上操作，维持低温，分离骨头用3%的pbs较好，冲洗确实应该用培养液最好

作者: chengge21 时间: 2012-10-31 10:23

回复 wujh1986 的帖子

密度梯度离心是用淋巴细胞分离液吗？如何操作？

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)