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标题: 有分离培养SD大鼠骨髓间充值干细胞的吗？ [打印本页]

作者: live861215 时间: 2012-10-26 13:10 标题: 有分离培养SD大鼠骨髓间充值干细胞的吗？

我现在做的是SD大鼠，刚开始做，我是用的是percoll液进行分离的，第一次没分离出来，第二次我配了1.090,1.077,1.067,1.055的梯度percoll分离，效果也不好，我每次用一只两周龄的SD雄性大鼠，能分享下你的经验吗？你采用的是什么分离方法。
先说下我的方法吧：6 |$ z( U1 \$ H- p2 Z# V( k" r9 R
首先准备两个培养皿，分别加入无血清低糖DMEM12ml与6ml；然后大鼠脱臼处死，放入75%的酒精中5分钟，取出后，取大鼠前后股骨放入第一个培养皿中，并去除肌肉，转入第二个培养皿中，再用5ml的注射器吸取培养基冲洗骨髓，再收集第二个培养皿的细胞悬液于离心管中，1000 rpm离心15分钟，去上清，加入1ml无血清培养基重悬细胞，再在另一离心管中分别加入梯度percoll液（由离心管底部至上分别是高浓度到底浓度的percoll 2ml），最后将1ml的细胞悬液加在percoll上，3000rpm离心25min，出现一层乳白色的薄层，用1ml的移液器吸取这层细胞，将其加入到一新的细胞培养盘里，加入10ml含10%FBS的低糖DMEM中，于37°，5%的二氧化碳培养箱中培养。. t( W' x) o2 G: P4 h1 B
希望指教！7 x- s+ ^$ V; I' F6 M2 W+ m
谢谢细胞海洋的建议！

作者: 86964109 时间: 2012-10-30 15:46

你说的效果不好指的是什么？是细胞量少还是不纯呢？我们用过Sigma的淋巴分离液Histopaque-1083

作者: live861215 时间: 2012-10-30 16:31

回复 86964109 的帖子

细胞少，长得慢，杂细胞也较多，你用的淋巴分离液Histopaque-1083是怎么分离的？结果如何？

作者: 86964109 时间: 2012-10-31 08:02

回复 live861215 的帖子1 Q! X8 {9 S" x! T/ ~

超净工作台中剪断股骨和胫骨骨干两端，显露出骨髓腔，用2 ml注射器吸取L-DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，吹打制成均匀的细胞悬液。
将骨髓细胞悬液缓慢加于HISTOPAQUE-1083分离液液面之上，3000 r/min离心30 min。, b/ U! y( d2 l# w( p }: X3 { U
离心后悬液分三层，取中间乳白膜层，1800 r/min离心10 min。6 ~$ V1 r2 G! l/ z4 N+ U+ \
用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮细胞，接种于6孔板中，培养瓶置于37 ℃、5％CO2饱和湿度条件下继续培养。; L9 f* M6 F5 [* y5 _% h+ n2 t0 \
我们的长得也有点慢，主要是怀疑培养基不给力

作者: wanglijuan_1989 时间: 2012-10-31 16:40

我们用的是全血培养，我觉得效果也很好，培养液用的αMEM，原代之后血清浓度可以高一点

作者: wanglijuan_1989 时间: 2012-10-31 16:44

错了，是原代血清浓度可以到15%

作者: 星火燎原 时间: 2012-10-31 20:31

杂细胞多了，原代首次换液的时间提前

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