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标题: 关于干细胞染色体核型分析的一些问题 [打印本页]

作者: SKC-SFC 时间: 2012-11-1 16:38 标题: 关于干细胞染色体核型分析的一些问题

近期在干细胞染色体核型分析前，在制备染色体的时候遇到以下情况：
1 .不知道怎么选取细胞，过早则看不到任何染色体形成，太迟形态也不对- d, @1 B' Y l) ?* u# d1 r$ ~
2 .最大的问题在于低渗处理的时候，没有办法破膜。' b& ]- o9 K& ^8 M3 [
求助：1.如果选择用于制备染色体的细胞0 S' N% u1 k, M7 C' f
2细胞低渗处理方法如何优化？& Z7 I+ B w% l) }4 D
谢谢各位i！

作者: SKC-SFC 时间: 2012-11-1 20:39

顶起

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-11-2 08:46

1、用秋水仙素
2、自己配低渗液，KCL好像是

作者: xbs530515 时间: 2012-11-2 12:14

选择的细胞，必须在对数生长期，这个就要根据你的细胞本身的特性，以及接种的密度都有关系了。你可以考虑一下取24h，和48h的比较一下，一般细胞都是这之间。实在不行的话，估计就要做个生长曲线来确定一下你的细胞的对数期。8 N9 b- A$ m2 x: d0 s- [ J
我认为你第二个问题也是因为没有选到对数生长期的细胞造成的，一般的话，低渗还是比较容易。你做个梯度，20min，30min，40min试试看，一般也就是30min就行的，所以，还是应该摸索一下你的细胞的对数生长期才是最关键的。

作者: SKC-SFC 时间: 2012-11-2 14:30

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$ E' \$ h& S H3 m
嗯，说得有道理，第一次有40%的细胞是可以看到分散的染色体，形态也很典型，固定和染色都不错。但第二次的实验结果失败，选取的细胞是36小时的细胞，低渗和固定后看到的细胞里看不到染色体的存在，低渗的话应该只是胀大，并不需要细胞膜破掉，我用的是KCl0.075M，作用时间为30min，秋水仙素的使用浓度为终浓度0.45ug/mL。

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-11-7 14:54

回复 SKC-SFC 的帖子2 Z l! J5 p' m( b

能看到分散的染色体，关键是滴片，注意利用热胀冷缩，具体方法不透露了。只要掌握好距离滴片，一般很容易的。

作者: SKC-SFC 时间: 2012-11-9 17:20

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! C: t, |3 P5 k+ a
嗯，说得很对，不过距离太高貌似滴不准

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-11-12 15:00

回复 SKC-SFC 的帖子5 [0 `: p2 X% t

7cm左右吧，一手拿吸管瞄准，一手拿冷的载玻片（注意要有雾气，没有立马不要），瞄准，然后快速滴，不管滴的怎样，快速滴20个板，最后画圈，用松脂封片（我个人比较喜欢松脂，本来还想手工做个琥珀呢）。熟能生巧，多练就越来越准的。加油啊
/ h, i- e7 R" p) K9 I
这个方法是老师傅的方法，不外传的，我说了。一定要给我很多威望和包包啊，要不对不起我啊！！

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-11-12 15:00

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2 A, k& O/ }! N, u$ Q+ P
70CM 打错了

作者: SKC-SFC 时间: 2012-11-13 09:06

回复突击兵之小土豆的帖子5 O. n; V' q! l" ^; @

70CM 要滴准，那技术得多精湛呢，而且滴片还是应该先滴一片，看看大致的细胞密度吧

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-11-13 09:10

回复 SKC-SFC 的帖子
) p7 K. b: J; ?$ Y% w& T3 F
利用热涨冷缩原理，载玻片事先放盒子里，在滴片前都是放在冰箱里，你滴完片，是要先封片的，观察一下，好的留下，不好的丢弃。即使你用软件进行核型分析，也会在处理数据时删除一些细胞图片的，不是每个图片都利于核型分析的。

作者: labghost 时间: 2012-11-14 14:43

回复突击兵之小土豆的帖子! r$ L X3 L- m; C! D. ^

要是再有点氯化钙就更好了。

作者: labghost 时间: 2012-11-14 14:46

将近一米的告诉滴下去，把一滴液体滴在一个载玻片上，7101,7102都在10cm²左右，能那么准，这技术真不是一天两天三四五六七天练出来的哈。

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2012-11-14 15:35

回复 labghost 的帖子4 a7 D7 i0 {2 ]2 b! h. S
: n' `/ l5 p. i5 w' _3 l' c
氯化钙我们倒是没加过很多东西没大家想象的那么难我记得我们小时候玩弹球就用弹球拿起来点射别的弹球个人表示无压力小时候玩弹球很准的哈哈

作者: 184lj 时间: 2012-11-16 12:21

只做过体细胞的核型分析，取对数生长期的细胞，终浓度0.4ug/mL秋水仙素处理2~3h；KCl低渗液处理；3:1甲醇病乙酸固定液固定细胞；调整浓度滴到-20℃冷冻的载玻片上（高度50公分就差不多了）。

作者: cartoonyang 时间: 2012-11-20 10:15

本帖最后由 cartoonyang 于 2012-11-20 10:18 编辑 9 M* P S: ^9 L2 v7 y9 I
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很好的帖子。
我之前做了很多体细胞的核型分析，分散效果一直不好。我在想，可能当初我没用预冷的载玻片有很大关系。
谢谢分享！！！

作者: cartoonyang 时间: 2012-11-20 10:45

Briefly, actively proliferating cells were incubated with colchicines (0.1 lg/ml) for 4 h at 37 _C. The cells were washed twice with DPBS, trypsinized, suspended in a chilled hypotonic solution (68 mM KCl) and incubated for 20 min at 37 _C and then fixed for 10min in chilledfixative (methanol and glacial acetic acid, 3:1). The pellets were suspended in 5 ml of chilled fixative for another 10min. The metaphase spreads were prepared by dropping the cell suspension onto ice cold glass slides.
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网上找的，我准备用这个方法试试。供分享！

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