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标题: 第一次分MEF，感觉细胞好杂啊 [打印本页]
作者: jun8013    时间: 2012-11-8 10:13     标题: 第一次分MEF，感觉细胞好杂啊

没有过筛，剪完消化后直接装T75培养，很多组织块还贴在瓶壁上，还有细胞好杂啊，细胞形态也不均一，我三个胚胎一个瓶，长得真快，过夜就的消化了，不知道怎么处理，尤其怎么去除那些组织块。
, z+ X9 G4 h2 b+ s8 Y+ d还有大侠们帮看看分得细胞。. A& V- t/ x+ T+ v


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作者: jun8013    时间: 2012-11-8 10:14

最后一个应该是就是组织块
8 b, Q  O" m+ w5 t9 E) A请教，下面怎么消化传代，主要想去除这些组织块，或者对后面实验有无影响。$ k- n6 M3 @6 |) z- b  N
大家帮看看这MEF对吗，状态如何。
作者: huangcong1988    时间: 2012-11-8 10:22

组织块贴壁没那么紧的，只要晃动一下就脱落了，而且还要用PBS洗的啊，洗完基本就没什么组织块了，然后就是，你这个没标照相倍数，没法判断细胞是否均一，另外一点，这个原代的MEF，你不会就要用于feeder制作吧？肯定要传两代啊，这样细胞会变得纯一点。
作者: huangcong1988    时间: 2012-11-8 10:23

如果担心组织块影响的话，下次滤一下，大概100目就行了，滤完会很干净，没有组织块，还有一点，3个胚胎一个T75瓶太浪费了，大概一个半胚胎一个T75瓶就行了
作者: jun8013    时间: 2012-11-8 10:28

本帖最后由 jun8013 于 2012-11-8 10:29 编辑 - a# R) d+ n# M( D6 T
! t) Q  G1 A$ H8 E3 a
回复 huangcong1988 的帖子7 u1 p! m3 y! o! U
" n" I2 y/ p3 s8 G
谢谢大侠指教，第一次分，也是在论坛上搜得，分离躯干时，剪的比较狠。。。。。感觉四肢难剪。。。。所以剩下的比较少，就三个一个T75，今天发现满了，打算穿下代，看看状态，那个是用10倍物镜看的。。。求指导
作者: jun8013    时间: 2012-11-8 10:30

回复 huangcong1988 的帖子/ H- g  `$ A3 M# W0 d3 T
, P+ q# L( n& s6 x$ |7 R( p
用PBS洗了5次，感觉壁上还粘着些，打算消化时自然沉降一会试试
作者: dilal    时间: 2012-11-8 11:59

MEF原代时就会有很多杂细胞，传代2次后基本上就剩MEF了，所以不用担心，等你用第三代细胞是基本上已经很纯了
作者: jun8013    时间: 2012-11-8 12:02

回复 dilal 的帖子
3 C  d" j$ Y3 T
  J# L/ q7 u- U2 D( u十分感谢指导~还有想请教下，P1保种好，还是P2好些。一个T75包几管合适。。。。
作者: dilal    时间: 2012-11-8 22:08

我一般做完原代就会冻存上一批，留上一瓶，传代到第3代后丝裂霉素处理，然后再冻存一批。
作者: Donnies    时间: 2012-11-9 09:17

你先把细胞传三四代之后，再看看结果怎么样，不同的细胞所需要的培养不同，像那些组织块，传三四代之后无法维持其继续生长就会消失的，另外传代的时候也需要注意一下，消化的不要太厉害，细胞一开始变圆就可以停止消化，不要等到细胞都漂起来了，再去终止
作者: jun8013    时间: 2012-11-9 10:20

回复 Donnies 的帖子
% q5 X; H1 P6 S+ u4 y
, O9 f. }! d$ e0 Q1 \2 l谢啦O(∩_∩)O~发现MEF长得好快啊，，，，，我几乎一天就的传。。。。
作者: 南宫燚岚    时间: 2012-11-9 11:48

分离原代MEF最好用体视镜，这样可以保证较好的纯度。; k7 P& S" D4 }1 y4 m
另外，分离完三四个胚胎之后就开始进行后续的消化等操作，不要等到十来个胚胎全部分完后在统一操作，胚胎活性不好分出来的MEF也会受影响，所以两个人流水线作业会比较好。关于铺板，我会2个胚胎铺一个T75，这样就不用第二天就满的不行要传代了……% U" G" T' u7 q# J" w- `1 b
贴壁后一天，我会用PBS洗一遍，大的组织块自然掉下来了，剩下的用真空吸管吸走，MEF增值能力强，会长起来的。而且传代的过程中组织块也会慢慢消失的。% F0 B( q- c: ]. Y0 l
培养液的成分也挺重要的，不知道你怎么配的。
作者: jun8013    时间: 2012-11-9 12:07

回复 南宫燚岚 的帖子( ]8 x9 D3 `2 T

# }7 Z/ e7 Z+ X8 _" i( R我三个胚胎一个T75发现第二天就满了，就消化了，组织块用PBS洗了5次，感觉少了，不过后面消化传代发现是几乎没有了，所以慢慢消化看样是可以的，不用过目筛。( K- M# H1 N( u4 i+ `
我培养基90%DMEM+10%FBS+2mM L-glutamine+P/S
+ Q8 h1 A( W( r. o/ l* c7 V全部过滤除菌，P/S Glutamine买成品，没过滤直接加
作者: huangcong1988    时间: 2012-11-9 15:05

回复 jun8013 的帖子- w5 _2 q9 ^0 `5 ~! E
4 K, ]: x* \2 e. o  o+ J
剪躯干干嘛呢？去头脚，内脏就行了，如果鼠小的话，还可以不去四肢，去头跟内脏就行。躯干剪碎的话，剪得越碎越好，剩下的东西再少的话，应该也能一到两个胚胎一个T75瓶，多了太浪费了，原代就冻，每代都冻，传一代冻一半。
作者: fwj81    时间: 2012-11-9 15:58

我做的MEF第一代也很杂，现在是第2代，感觉好多了。胚胎成纤维细胞出来了。上图：

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作者: jun8013    时间: 2012-11-9 16:18

回复 huangcong1988 的帖子2 I7 F1 e; F1 `' Z- J8 h6 ]

3 }) @0 N$ z3 Q- T2 t- {原代没冻现在打算没代就动，长得太快了这MEF
作者: huangcong1988    时间: 2012-11-10 09:25

回复 fwj81 的帖子( r# @' L. y9 I- ]6 ?- ~
6 X( [2 |0 M: U: B
10倍镜下看的么？还是有点杂，感觉。
作者: huangcong1988    时间: 2012-11-10 09:29

回复 fwj81 的帖子
) z( v" N0 y4 X* s
; ~1 P7 e. p, [这是我上次分的

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作者: 南宫燚岚    时间: 2012-11-10 09:45

回复 jun8013 的帖子8 D' D5 y7 m" c4 ~

2 L) n9 W( D" `( C8 W: G7 JFBS最好灭活一下
作者: jun8013    时间: 2012-11-10 11:20

本帖最后由 jun8013 于 2012-11-10 11:25 编辑 / q% C3 y( G, m/ u& d4 l

% R2 Q0 G& O5 g5 U4 x: R9 k  l6 [回复 huangcong1988 的帖子# `$ F& L* x$ [9 Q9 k, T& n
, J6 w5 y$ j! c2 m7 p
太好了，收藏下。请问前辈，您胰酶消化时用多少浓度的0.05%还是0.25% 。还有消化时有一些没消化下来的，感觉还不少，4倍镜下看，这些细胞还要吗？是不是老点的细胞难消化啊$ g0 l' Q, J( i2 G0 ?: ^/ U% r
: G- t: c' f7 _5 a1 C! d* e1 X
0.05%消化多久，我感觉我消化了快5min钟
作者: jun8013    时间: 2012-11-10 11:22

回复 南宫燚岚 的帖子9 L9 L: e' a4 {6 M. z

! y3 F5 [- ]. |9 I, z您意思是热灭活？买的进口的，应该还是要热灭活一下，说的有道理！下次灭活下看看
作者: zhusealin    时间: 2012-11-10 17:09

有组织块也不要紧，随着后面传代会逐渐消失的。MEF需要密一点生长
作者: huangcong1988    时间: 2012-11-12 08:01

回复 jun8013 的帖子9 A% k7 @0 G  A$ P2 W

$ I3 P& Q1 Q6 j, C  Z. U你是说消化传代还是说分离细胞的时候？传代的话，5min太长了，消化的话5min就太短了，所以你分的细胞少。浓度都可以的，0.05跟0.25差不多，组织块多就用0.25.少就用0.05，主要是控制用量，还有消化时间，我一般是10ml左右胰酶，20min，一只母鼠
作者: 南宫燚岚    时间: 2012-11-14 08:59

本帖最后由 南宫燚岚 于 2012-11-14 09:04 编辑
$ c% w# ^- ]$ Z- |' Q8 u* d! \  |4 N
消化下来的细胞完全够用了，所以瓶底那些没掉下来的扔掉就可以了。
6 O: \9 a+ U/ k& R0 g6 t另外，不要让MEF长得太满，100%已经是上限了，只要90%以上就能传代，如果你发现MEF长得很快的话，那在传代时可以采取1:3以上的比例，然后舍弃一部分呗。
, l1 b0 ^' d- n这是我分MEF时的图片：（不知为什么你们的都是紫色的？是CCD的关系么？）
7 u: d2 Z( |- M% f% {5 |* o2 {% i2 Z0 O
分完第一天，因为是体视镜分离，去头尾四肢，所以细胞数比较少
& a7 g* K5 M. N Captured 10X 1.jpg ( o; r% f9 _" V* R/ A

4 z* P+ Y% ~2 M! E/ O4 A4 I! H第二天就长起来了
, s4 T) ]; S( B- \) U% |9 _; v Captured 10X 2.jpg
; x$ P6 g! D/ P1 S, E
1 i* _6 I( B/ e5 h- Q4 T第三天就该传代了# c  z8 d' X; a& C% X
原代第三天，需要传代了
) g, v& P+ F8 k# r* F( ]( J# M% ^# N5 y/ }. G1 j7 o  F
两代过后，细胞纯度有所改善
* K$ Q6 G( b& ]4 f) [6 W9 @+ q 传代两次后

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作者: labghost    时间: 2012-11-14 14:22

回复 jun8013 的帖子+ ~: y1 B) W2 ~, K+ l* i" p% F
$ Z5 m" d1 U) c7 O" [
不是，感觉是培养皿是脏的还是怎么的，觉得你这成纤维细胞状态不对啊。



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