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标题: 问个抽质粒的问题，Cartidge可以用布氏漏斗+滤纸代替吗？ [打印本页]
作者: mhqh    时间: 2012-11-21 15:44     标题: 问个抽质粒的问题，Cartidge可以用布氏漏斗+滤纸代替吗？

我用Qiagen的Mega方法抽质粒，就是一次能抽2.5mg的那种，加了P1，P2之后，有一步是过滤，把裂解的细菌啊蛋白啊什么的过滤掉。但是，Qiagen的那个叫Cartidge的一次性抽滤装置真心贵啊…… 我查了一下，可以用离心代替，但是离心好麻烦，因为溶液好多。 请问我可以用  布氏漏斗 + 滤纸 + 抽滤瓶  代替吗？  我感觉是可以的，但是没做过，抽质粒也没经验，请问有人做过吗？谢谢！
作者: 86964109    时间: 2012-11-21 16:38

回复 mhqh 的帖子9 `% ~& N$ D% l& S3 ~
- o" u0 m' X( y/ _( z  m
没这么做过，我们一般都是异丙醇沉离心的，也不算太麻烦，你可以先取一部分过滤下试试，检测下收率，看看质粒会不会吸附在滤纸上
作者: mhqh    时间: 2012-11-21 17:18

本帖最后由 mhqh 于 2012-11-21 17:18 编辑
# x: E. t3 F/ k
/ t. _% D( Y8 w" K4 S! n% ]9 m回复 86964109 的帖子( h# t+ K/ V' K5 Z0 l

! @. j) m( E! O3 Q1 {. ~谢谢你的回复！！！3 ]* Q$ ~6 [( k* L' b& ]7 J/ c

0 K0 N: y, M0 ~- j. v不过，你好像误解我的意思了。。。 异丙醇沉淀离心是最后几步吧？ 我的理解是这样的： 先裂解细菌，然后过滤，把裂解物啊残骸啊蛋白啊去掉（我问的是这一步）（据说这一步可以离心，渣滓就沉下去了，取上清液，但是好麻烦，因为加了P1，P2，P3之后，溶液至少150mL了），DNA在过滤下来的滤液里。然后用Qiagen-tip过柱子吸附DNA，最后才是异丙醇沉淀DNA离心得到DNA……8 [" H& R2 d* D2 N
' A- B$ [' Q. Z/ T0 a* k# h
其中，过滤那一步，Qiagen的那个叫Cartidge的装置真心贵啊…… 感觉原理上就和化学上最经常用的布氏漏斗抽滤装置一样，不知道能不能用布氏漏斗？谢谢你！
作者: 86964109    时间: 2012-11-22 08:04

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( d2 w" t" P! m1 ?* @
! ]! @0 ^' o* o感觉应该是可以的，不过可能还是会有一部分核酸会吸附吧，先拿一部分试一试，
作者: mhqh    时间: 2012-11-22 12:16

回复 86964109 的帖子) {  ]) l  m  o. r8 i/ |/ H

/ k- A4 w0 C3 n( w, K: F3 B( R谢谢你！！～
作者: weiyepan    时间: 2012-11-27 23:59

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# H/ P* G3 n5 K. t" g# D
  W( B) R3 i( x% j离完心再过滤，效率会高很多。4 L! u% \" ?1 N0 Y- N
另外，推荐一个牌子， MN的便宜又快速，在clontech有代理。
作者: mhqh    时间: 2012-11-29 18:49

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8 u: F) ?; ?/ {1 }$ m- \4 }
3 K+ N, _% @( }% X. J! q您好！谢谢！+ g2 c9 B! b( s2 Y( x5 o
. w" I( u- Y: H1 L* R
还有个问题，抽滤之后，有一步是，加 50mL buffer FWB2，我等到菌液都抽滤下去后，滤纸都被堵住了，再加FWB2就很难滤下去了，然后我就直接往底下的滤液里面加了... 这样操作会有问题吗？我不知道FWB2是干什么用的...
作者: weiyepan    时间: 2012-11-30 22:20

我好像没见过QIAGEN离子交换类型抽质粒的buffer里面有FWB2的啊？
( R0 {" Q7 D# Y6 Q) t& ?你能把protocol贴上来？
作者: weiyepan    时间: 2012-11-30 22:20

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, W! ^7 ~' e" v+ v" n1 Q
0 {# |* m& C- f* v" n我好像没见过QIAGEN离子交换类型抽质粒的buffer里面有FWB2的啊？
. u$ `1 z6 i+ |) ^$ i3 N; V你能把protocol贴上来？
作者: rexhz    时间: 2012-11-30 22:28

回复 weiyepan 的帖子+ ^+ g7 ]& q5 e, y

! q( x) D6 ~/ z2 X8 ?4 T& nNucleoBond® Xtra Maxi 是这个吗？
作者: weiyepan    时间: 2012-11-30 22:41

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/ P, V1 X2 Q5 Z3 P. o9 d# {* b" s6 K5 r) U: K: @
对，这个很好用，便宜。好像能有个25%~50%的折扣，自己磨下嘴皮子。
作者: rexhz    时间: 2012-11-30 22:45

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+ a9 ?7 G$ q$ ?6 E! _) G  j* v) W! L( g5 \! A8 Q" ]  F$ K" Z
看了一下确实好便宜啊，中提的那种10次500块。能不能像QIAGEN柱子一样洗过重新用啊
作者: weiyepan    时间: 2012-11-30 22:58

顺带提醒一下，中提是500ug的，碉堡了！重新用个两三次应该没有问题，不过它是silica menbrane的matrix，QIAGEN的是树脂，按重复使用来说应该是树脂的次数会多一点。但是如果按流速来讲是膜类型的要快很多。
作者: mhqh    时间: 2012-12-1 01:17

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8 k: s* r- d$ C4 K; t! q
+ O3 o9 ]7 }- [  k' B如图 xx1.jpg xx2.jpg xx3.jpg

图片附件: xx1.jpg (2012-12-1 01:12, 54.16 KB) / 下载次数 145
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NDc5MzR8MWI5ZjgxOGF8MTc5MzExNTM4MHww



图片附件: xx3.jpg (2012-12-1 01:16, 56.02 KB) / 下载次数 125
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NDc5MzV8NWQ5OTcyM2N8MTc5MzExNTM4MHww



图片附件: xx2.jpg (2012-12-1 01:16, 65.84 KB) / 下载次数 120
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NDc5MzZ8N2E0NmNkNGZ8MTc5MzExNTM4MHww

作者: mhqh    时间: 2012-12-1 01:29

本帖最后由 mhqh 于 2012-12-1 01:31 编辑 ) e; F8 H% R# t7 T

$ F- j/ K( T" B' ]回复 weiyepan 的帖子4 J# J$ r+ E6 }, A3 O
% o- L& R3 \- k4 r$ t1 g: L. o' w
你好！我把我做的的配方和流程贴上来了，按qiagen的Mega方法做。今天又抽提了一次，没加FWB2，最后好像也能抽出来DNA，我不知道加不加FWB2对产物会不会有什么影响？我不知道FWB2有什么用…… 配方和流程见楼上的图4 Y; l. e' i, }: H' I
: w: J# M1 v, D

& b0 Q& a% y( I7 j7 Y9 z还有，可以麻烦你把你说的那个什么MN的链接贴一下吗？我找了，没找到啊...囧... 不要鄙视我... 1 x' t3 A; ~' Y$ A7 Q
$ N# y! R: d7 T/ F9 X9 k
再次感谢！
  q& ^# v) D1 \- S! L
作者: weiyepan    时间: 2012-12-1 02:12

回复 mhqh 的帖子: K$ d7 `, L  E

0 l. f# O! N% ^2 u7 k我看了那个protocol，那个FWB2就是把你剩在膜上部的DNA洗出来，增加回收率。你不用当然能提出DNA来，但是产量会低一点。另外你用普通的膜去过滤，也会有一部分残留在膜上。如果你的布氏漏斗是硅质的，那也会有一部分DNA结合到漏斗上，下次提DNA的时候有可能会污染。) V9 b0 b- D( }* Y4 B
MN的在国内也是clontech代理，具体我不是太清楚。10楼好像已经找到了，你可以问问他。
作者: zhangtcm    时间: 2012-12-1 12:57

回复 mhqh 的帖子: n/ H. |( U, Z8 D; b$ B

0 E) ^, q% F8 j( `. A+ t& J8 K其实国产的大抽的，质料也可以的，我以前用过，可以用来转染的，效果也差不到那里
作者: mhqh    时间: 2012-12-1 17:37

回复 rexhz 的帖子" c. y* K  x/ F) g

8 e, u. h+ B6 X$ D5 R求链接…… 谢谢！
作者: mhqh    时间: 2012-12-1 17:37

回复 zhangtcm 的帖子
- j! ^( ^7 z, _8 F: L' I" X+ J
# a0 H8 \5 g: r: O求链接……谢谢
作者: mhqh    时间: 2012-12-1 17:37

回复 zhangtcm 的帖子
2 ~# l5 Y8 J) T, [
6 x5 u) N8 l  [/ s3 ?4 Z求链接……谢谢
作者: 小刺猬2932056    时间: 2012-12-3 15:20

我觉得你可以尝试一下，但我之前用那个做个一次，当时不知道什么原因过柱子后竟然滤液不清透，还有少许的絮状的东西，那滤膜很厚的，然后我把滤液又用新的过了一次，把老板给心疼的啊
作者: weiyepan    时间: 2012-12-3 22:04

回复 zhangtcm 的帖子
& h& V4 H! S" o* S! \
4 \. a2 _3 _; l& E/ k  Y2 u! B国产的大抽不是说原理上做得比国外差，现在抽质粒的方法都很成熟了。但是，国内的原料质量不稳定是肯定的，至于质控有没有做好，那是看一个个公司的良心了。
' f) z8 B; l5 F4 e另外，QIAGEN和MN的大抽都有用的离子交换。现在离子交换方法的kit不多，成本高，国内销量不好所以没人做。国内用的都是硅羟基方法的，这种方法很难去除内毒素。至于说转染有没有问题，一个是看最终抽出来的浓度，另一个是看细胞好不好转。如果说都转的293T，那我看PEG沉淀也能做。
作者: sunnh11    时间: 2012-12-4 10:50

完全可以用漏斗和3M滤纸代替，以前没有Cartidge时，我们常常用过滤代替离心，没发现什么问题。
作者: zhangtcm    时间: 2012-12-4 15:14

回复 weiyepan 的帖子
# X% l: p6 v2 ^& `- y9 m- y% `+ z* j5 f$ W) }- X1 ~
我那时候，大概是07年吧，用的是质粒抽提试剂盒，北京天为生物公司；其中一个是GFP的，转染P19细胞，还是可以的。3 r3 p' w& u7 |
DSCN3521.JPG

图片附件: DSCN3521.JPG (2012-12-4 15:14, 687.56 KB) / 下载次数 189
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NDgwMjJ8NjIyNjA0MzB8MTc5MzExNTM4MHww

作者: zhangtcm    时间: 2012-12-4 15:18

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5 H2 k3 P9 ]( `1 O' C! D. P
2 A9 ]8 q/ a1 ?5 F& u/ l0 n我那时候，大概是07年吧，用的是质粒抽提试剂盒，北京天为生物公司；其中一个是GFP的，转染P19细胞，还是可以的。
+ J' K6 N5 m) i5 G DSCN3521.JPG

图片附件: DSCN3521.JPG (2012-12-4 15:18, 687.56 KB) / 下载次数 181
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NDgwMjN8NzEzOGMyZjd8MTc5MzExNTM4MHww

作者: mhqh    时间: 2012-12-4 17:00

回复 sunnh11 的帖子
+ h- K  h; P& g" \1 i: R# Q; C" n3 B# x6 z
谢谢！
- \4 s% f9 ]. c" c: l5 {3 `# q% j" n3 z( Z* U( A" m
我有个问题，你是用抽滤还是常压过滤？就是我用布氏漏斗抽滤，就是底下用水泵抽，然后很快就漏下去，但是，抽了之后，蛋白质就把滤纸的孔堵住了，用那个FWB2的时候，就再也抽不下去了... 怎么办？
作者: ouyi2738    时间: 2012-12-4 19:28

我们用的也是MN（macherey-nagel）的maxi，比qiagen的好用，不用抽滤，我在过滤纸前都简单离心一下，撇去上层的白色裂解物，滤的速度更快。
作者: 祁门红茶    时间: 2012-12-5 14:13

本帖最后由 祁门红茶 于 2012-12-5 14:14 编辑
9 U; M( Q# ^1 S! u5 k
% _0 D# {& R8 R% e9 ~4 J" J5 N回复 mhqh 的帖子( y- T. i7 j, \; C8 N! E; m. ~- A
/ f1 c* B( Y4 F  G. \6 e
应该不可以，这个材料应该是带正电荷的，不是起到简单的过滤作用，是可以吸附质粒的。
作者: mhqh    时间: 2012-12-7 13:33

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+ l% }! c% s6 r( s) a2 [
0 K+ `4 m( c9 H$ _$ Y- K( S额。。。 质粒在下面的滤液里好不好。。。 吸附了不就杯具了。。。
作者: mhqh    时间: 2012-12-7 13:34

回复 ouyi2738 的帖子5 j: i3 @8 b: ]2 X
  o2 t, d, Q! w0 Y5 s
谢谢！！



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