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标题: 液氮罐内冻存细胞是否会污染？ [打印本页]

作者: rongcuizhen2005 时间: 2012-11-27 11:10 标题: 液氮罐内冻存细胞是否会污染？

各位，请教，之前我们实验室液氮罐冻存的细胞取出后，微生物培养结果，结果有长菌？不知道是不是液氮罐内引起的污染？请高手给分析一下

作者: tjbone 时间: 2012-11-27 11:56

应该是冻存前被污染了！！！！！

作者: 歪歪 时间: 2012-11-27 12:54

有一定的可能性，很多微生物在液氮中是没办法杀死的，而现在市面上的冻存管口为了适应温差，热胀冷缩的时候不至于爆管，都是无法密闭的。所以液氮罐中的液氮是可以从一个管子进入到另一个中。特别注意是支原体，来源广泛，防不慎防。所以现在有些大的实验室，采取非接触式的液氮循环系统，来保存一些比较珍贵的细胞系。

作者: canoecheng 时间: 2012-11-27 15:21

也不排除解冻时候的污染

作者: xiaolong 时间: 2012-11-27 16:02

可能是冻存时就已经污染了，再要么复苏时不小心污染的

作者: weibin2002 时间: 2012-11-27 21:46

有可能是你冻存时细胞就污染了或者是复苏时候某些细节不到位引起污染的吧，
我以前复苏过一次在液氮里把管冻裂的细胞，融化后发现管上有个裂痕，有酒精多喷喷就复苏了，也没有污染，呵呵！

作者: rongcuizhen2005 时间: 2012-11-28 08:22

回复歪歪的帖子/ V7 ^- M" ?- h) B' v
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冻存之前一般我们实验室都会做微生物培养的，没有问题，但是解冻时就出现污染情况，请问是不是冻存液污染引起的？有没有这种可能性？冻存液的成分是DMSO/血清/DMEM

作者: sdwzg119 时间: 2012-11-28 08:43

我认为从水浴中的水里带入污染的可能性大一些！

作者: 歪歪 时间: 2012-11-28 10:09

为了排除水浴锅的问题，那你可以试着水浴锅中的水加热100°，灭一下。或者复苏的时候拿一管放在培养箱中复苏，尽管细胞状态不好，起码可以排除外援引入的污染。 L% \ m4 i0 f; e* X& q# J
还是不行的话，估计就是冻存液的问题了。我们实验室冻存液都会过滤一下再用。

作者: rongcuizhen2005 时间: 2012-11-28 11:33

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但是冻存液中有DMSO,可以过滤吗？会不会对滤膜有影响？

作者: jack1381818 时间: 2012-11-28 11:53

使用熱縮膜及乾式液態罐可避免交叉污染

作者: 279042256 时间: 2012-11-28 12:41

细菌在液氮中基本冻不死，这个用时间长的液氮罐干了以后可以到出看看底部都很脏的。所以现在有条件的实验室和人医上开始采取非接触式的液氮循环系统。

作者: 327670562 时间: 2012-11-28 13:20

一般情况下是不会的。。。。。。

作者: weibin2002 时间: 2012-11-28 20:04

DMSO号称万能溶剂，如果虑会把滤膜给融了的吧。可以把其他成分虑一下在和DMSO混合。不过如果血清和培养基有问题，培养过程中就应该发现啊！- ?5 s4 I: _) m5 O
可能是水浴锅的问题吧，建议消毒、换水，然后在水里加上0.1%的新洁尔灭。我们实验室就是这样的

作者: NK细胞 时间: 2012-11-28 22:01

细胞冻存前和复苏过程中污染的可能性较大，但不排除液氮被污染，因为呈看到过某实验室液氮被支原体污染，导致整个液氮罐细胞污染。对于排除液氮污染，不知大家有什么好的方法没？2 Z4 t' L/ O# P: Z

作者: 歪歪 时间: 2012-11-29 06:50

不会

作者: sandy 时间: 2012-11-29 09:50

会，支原体

作者: mkhorse 时间: 2012-11-29 10:00

有可能啊，所以采用气相的液氮储存罐来避免储存细胞间的交叉污染

作者: deshenglll 时间: 2012-12-3 09:20

大多数是在冻存前就污染了。

作者: Donnies 时间: 2012-12-3 11:24

一般情况是冻存之前就污染了，冻存管是密封的，一般不会污染的，除非冻存管裂了，有可能你没发现，不过这种情况应该很少的

作者: avacfr 时间: 2012-12-14 13:26

如果是密封完好的话，液氮污染的几率很小，估计是冻存前已经污染了的，或者在复苏过程中污染了

作者: yinfuhua 时间: 2012-12-14 13:53

回复 rongcuizhen2005 的帖子" f+ v8 b% V& y a0 w# n

可以采用内旋式冻存管，密封会好些。操作的各个环节都要注意才能保证细胞不被污染。

作者: ag2017 时间: 2013-1-5 11:14

污染的可能性有三：1、冻存前试剂、耗材或操作过程污染。2、看你冻存使用的气相罐？液相罐冻存？还有就是你冻存使用的是漩口冷冻管还是热合冷冻袋？一般情况下冻存造成的污染可能性较小。特别是气相罐。3、解冻过程污染，解冻过程建议将冻存的细胞放入无菌手套包裹后再浸入水浴槽解冻。

作者: rongcuizhen2005 时间: 2013-1-24 10:38

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学习了，谢谢！

作者: rongcuizhen2005 时间: 2013-1-24 10:38

回复 ag2017 的帖子
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学习了，谢谢！

作者: rongcuizhen2005 时间: 2013-1-24 10:39

回复 ag2017 的帖子' @) {8 x7 b! X; L$ q
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学习了，谢谢！

作者: aiweieryezhi 时间: 2013-1-24 13:30

冻存液有问题的可能性大，还有就是复苏时的操作都有可能污染。我们经常冻存、复苏细胞，基本没污染过。水浴锅也不能排除。如果你能排除不是细胞冻存之前就污染的话，你就从以上原因找。至于过滤冻存液的问题，我们是从来没做过。其他也很少有人做。所以，还是从你的自身找原因吧。

作者: aiweieryezhi 时间: 2013-1-24 13:31

冻存液有问题的可能性大，还有就是复苏时的操作都有可能污染。我们经常冻存、复苏细胞，基本没污染过。水浴锅也不能排除。如果你能排除不是细胞冻存之前就污染的话，你就从以上原因找。至于过滤冻存液的问题，我们是从来没做过。其他也很少有人做。所以，还是从你的自身找原因吧。

作者: 小冬子 时间: 2013-1-24 13:54

回复 rongcuizhen2005 的帖子

我们实验室的冻存液是过滤后用的，血清过滤，DMEM过滤，DMSO过滤，混合到一起后避光4°备用。个人认为，液氮罐内的污染不太大，但有这个可能。更多的是冻存过程中操作引起的污染，或者复苏。水浴锅的水一定要经常更换。。。

作者: monk125 时间: 2013-1-24 14:40

细菌真菌什么的-100度以下都会死掉的唯独支原体你懂得！！！！这个问题以前讨论过的，有可能的，所以冻存管盖子要盖好！！液氮也是污染的媒介，本来灌进去的液氮可能都很脏的

作者: monk125 时间: 2013-1-24 14:41

回复 rongcuizhen2005 的帖子! e+ }8 Z6 A+ u' \
! J" m/ c. V9 A
我试过，可以过滤的，严谨讲，用于冻存的DMSO应该过滤，否则有危险

作者: dandan_lan 时间: 2013-1-24 15:47

液氮这么低的温度，有污染也不会传播。

作者: 予彦 时间: 2013-1-29 11:17

回复 monk125 的帖子6 a" h7 \5 Z' c7 g
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请教你是用什么过滤的？我用0.22的滤膜，感觉DMSO把滤膜都要融完了，后面像自来水管一样漏，都没效果

作者: lzc 时间: 2013-1-29 11:54

之前我们也有过这样的情况，冻前有检查，无污染，可拿出来后，未经水浴锅解冻，直接检查还是有污染，目前这种液氮罐的冻存模式还是需要很大改进啊。

作者: monk125 时间: 2013-1-31 14:16

回复予彦的帖子

DMSO是两性溶剂亲脂也亲水我们也是0.22uM孔径的滤膜，注射器推进快速过滤

作者: ditiger 时间: 2013-2-2 17:43

肯定是冻存前污染或冻存的过程中发生污染，在液氮中污染的可能性非常小。
也有可能是冻存管没有拧死，在复苏时水进去了。。。

作者: sdfengxuan 时间: 2013-2-16 15:06

有可能是复苏的时候，水浴出了问题!

作者: daviddow 时间: 2013-3-3 12:18

不会，要是会了就没人用了

作者: 硕果累累_555 时间: 2013-3-4 16:32

一般是冻存前污染因素比较大，若不是该原因就是水浴溶解的原因，冻存管的盖子不能淹进水里，否则会容易污染。

作者: 沙漠狐o0 时间: 2013-3-4 16:42

水浴锅里加新洁尔灭？水浴锅里直接用灭菌的去离子水，一般水浴锅里有Ag+可以抑菌的。

作者: crazytime 时间: 2013-3-7 16:01

液氮中可以存在少量支原体，而且冻存管在低温下，密封是很差的，所以在液相下冻存的细胞有可能感染支原体，但是细菌污染的话，应该是冻存之前就污染了

作者: abgg 时间: 2013-3-8 12:50

回复歪歪的帖子. C: | N% s5 G3 M0 w9 ? q

权威！

作者: 三月桂花香 时间: 2013-5-13 11:22

冻存前除了做细胞表面抗原分析外，都会进行无菌检测，复苏时会进行支原体检测，这种情况要么是冻存前就已经污染，要么就是在复苏过程中被污染。

作者: iytbxxg 时间: 2013-5-14 10:53

DMSO都不用过滤吧，我之前从来没听说过DMSO要过滤的，能在DMSO中生存的生物我目前还没有听说过，一般复苏后污染的可能性有一冻存前发生污染，不单单是细胞来源，冻存管都有可能，很多冻存管用的时候管是没拧紧的。二是保存环境造成污染，我在学校时候再细菌扔到负80，拿出后还是有活的，哪么细菌在液氮里还是有能活下来的。三是复苏过程造成污染。所以你还是从这几方面检一下是哪里出问题了

作者: huangcong1988 时间: 2013-5-16 21:19

回复 rongcuizhen2005 的帖子# s6 s# _! m3 g: H/ l6 x( {: J* T0 V
' Y0 y: l7 ?( M. P+ W
请问，你冻存后复苏情况怎么样？

作者: deshenglll 时间: 2013-5-23 13:33

有一定的可能性，液氮会进入到冻存管内的。有条件弄个气相罐。没条件的可以找些冷冻套。将冻存管封起来。

作者: yunshi503 时间: 2013-5-28 20:04

也是存在污染的可能，特别是混装的液氮容器。建议细胞单独贮存，尽量无菌环境操作。

作者: BDFCM 时间: 2013-6-6 16:59

你可以做个试验：
把冻存管只加冻存液，不加细胞，然后和细胞一起冻到你的液氮罐里，然后一起取出复苏。细胞就按常规程序，冻存液就取几微升，接种到新鲜培液中，看看是否有污染。

作者: uslzhang 时间: 2013-6-6 17:19

一定会被污染，因为冷冻时冻存管都发生变形，盖子是无法真正盖严的，泄露液氮进去就不可避免了，液氮成为了交叉污染的媒介，这些其实很容易想象得到。

作者: Hellfire 时间: 2013-6-9 10:10

个人认为，产生这种污染的情况可能有以下三个原因：3 U; O, N) Y9 g: J' k9 c
1、液氮罐中可能有其他标本感染，然后液氮罐内的其他样本不同程度的被污染，有些细菌、支原体什么的低温是不足以杀死它们的。0 k# C: m3 R# K3 H5 ~
2、复苏细胞使用的水浴箱的水可能污染了，最好检查下，彻底消毒。
3、细菌培养的假阳性。

作者: anzhida0823 时间: 2013-6-9 10:19

建议复苏的时候选用无菌的纯水，冻存管或冻存贷装在自封袋或采用其他办法，让冻存管或冻存贷与水浴锅中的水隔离不接触，这样应该可以知道是否是复苏时候污染的。对于冻存管口容易冻裂，建议冻存时候在冻存前在冻存管口缠上两层橡皮膏，呵呵

作者: mjc588 时间: 2013-6-11 17:18

DMSO是剧毒，应该不是DMSO的问题吧

作者: 永远的伊凡 时间: 2013-6-25 17:29

回复 jack1381818 的帖子

请问一下热缩膜怎么用，你用的是什么牌子什么型号的？谢谢了

作者: jack1381818 时间: 2013-6-26 09:35

回复永远的伊凡的帖子& d7 w+ `1 B6 J' Q) R* R
! n: |5 P/ g/ V& j
細胞超低溫保存瓶熱風封口機 http://www.deagle.com.tw/fb_product_detail.asp?pro_ser=8147
或熱風机3 T+ c4 p" B3 q' }
牌子Nunc CryoFlex™ provides extra safety when freezing hazardous samples or storing in liquid nitrogen

作者: 永远的伊凡 时间: 2013-6-26 10:15

回复 jack1381818 的帖子2 r; I; Z( J+ F. Y; a+ u7 p7 L

好心人，谢谢了！

作者: crazytime 时间: 2013-7-1 10:57

细菌等应该不是在冻存过程中引入的，一般只有支原体才可以在液氮中存活，至于DMSO不需要过滤。如果要的话有专门过滤有机试剂的滤膜: y, L) @" e2 \6 D3 g: H) ~" Z4 \( a

作者: xld1984 时间: 2013-7-1 11:13

冻存的时候有可能污染，也可能是复苏时污染的。在液氮中理论上是有可能污染的，单几率小。+ l; G0 r' b" a/ y% D& ^
珍贵的细胞可以买气象冻存罐。

作者: uslzhang 时间: 2013-7-1 11:44

不污染是相对的，污染是绝对的。冻存管在加入液氮后多少会发生一点变形，造成盖子无论怎么盖都不可能绝对严实，因此冻存管内漏一点液氮进去的可能性极大，这时液氮成了污染微生物的媒体。

作者: sdzhzwf 时间: 2013-7-11 15:33

我接触的是脐血，如果冻存前做细菌培养的话，应该不会被污染，但是如果在复苏的过程中被污染可能性也是有的，毕竟复苏之后因为血量的原因已经不能再做细菌培养了

作者: 好雨知春 时间: 2014-1-22 11:29

气相冻存安全一点

作者: jojo1988509 时间: 2014-1-22 14:26

回复 rongcuizhen2005 的帖子' A( ~0 F$ D3 R# e" {3 c
$ q% E2 L b( T2 Y- k, N1 i
为什么要过滤DMSO啊？DMSO会溶掉滤膜的……我有一次用它作为溶剂配好试剂后过滤，结果滤膜没有了，DMSO根本不会出现污染。

作者: wf78365421 时间: 2014-1-27 15:35

本帖最后由 wf78365421 于 2014-1-27 15:41 编辑
$ _7 \, N' X, R% Y
1、有可能冻存的时候污染，也可能是复苏时污染。当然，在液氮冻存中理论上是有可能污染的，但几率小，主要还是操作的污染。, j# O% ^$ w3 B& r
2、如果你用冻存管，因为在深低温时冻存管会缩小，常温下拧的很紧，但深低温会变松，有液氮进入的可能，但在液氮状态下，如果不加冻存液，各种细菌理论上均被冻死了，不会污染。

作者: yiyi8909 时间: 2014-3-13 19:44

冻存的细胞有时候冻存管里有液氮，不过好像没有污染，可以用

作者: sc-cxw 时间: 2014-3-14 10:57

个人经验，解冻过程中，37度水浴过程中，水浴锅中的水容易浸润到螺口冻存管的螺口处，进而污染细胞。

作者: xxue311 时间: 2014-3-19 10:59

多数是冻存前污染。

作者: 461650833 时间: 2014-3-19 14:48

复苏活着冻存的时候污染的可能性最大！

作者: yeungfan 时间: 2014-7-24 10:52

冻存前污染，或者复苏后污染的几率比较大

作者: woshibotao_01 时间: 2014-9-15 11:58

冻存管拧严了应该不会发生进去污染物而发生污染吧。
觉得还是在冷冻之前严格无菌操作，防止污染的发生。

作者: deshenglll 时间: 2014-10-17 10:15

回复 rongcuizhen2005 的帖子! O' p5 D$ K7 h& j
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可能是冻存前的，也有可能是复苏的时候造成的。在复苏的时候冻存管会有个膨胀的过程，你不注意水是会进到冻存管里的。

作者: deshenglll 时间: 2014-10-17 10:16

回复 rongcuizhen2005 的帖子

冻存液中的DMSO主要还是靠清洗。用培养基或生理盐水啥的去稀释DMSO的浓度。

作者: deshenglll 时间: 2014-10-17 10:17

回复 rongcuizhen2005 的帖子
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你可以用个PE手套把冻存管套上复苏。或者在冻存的时候就可以加个套子。NUNC公司有相应的冻存管套。

作者: xiaostou 时间: 2014-10-21 10:27

液氮罐内污染微生物或者其他细胞系是一个特别常见的问题，因为液氮是流动的，而常用的冻存管，不管内旋外旋，不管拧多紧，都会进液氮，这个我们做过实验的。# U3 U8 @ E0 K# f, }$ ] U

对于珍贵的细胞系，只有两种办法，一种是楼上提到的冻存套管，需要买一个风嘴比较小专门的吹风机；另外一种就是液氮气相保存。

作者: 帝国黑骑士 时间: 2014-10-28 08:49

液氮罐污染的可能性不大吧，要么是冻存前要么是冻存后污染的，液氮里不可能长菌啊，你可以做个试验啊，在复苏一管其他的试试，注意无菌操作。我以前就做过，冻存的细胞检测的时候污染了，但是在液氮里面对其他的没什么影响的，直接拿出来丢掉。

作者: 龙七 时间: 2015-2-27 13:01

分析原因有：
1、冻存前细胞样本就已经污染了；
2、在水浴锅复苏时给污染的；（可能性最大）
3、冻存液污染的几率也是有的，但比前两个几率小很多；

作者: alicia_86 时间: 2015-3-3 09:03

我觉得是你冻存前就污染了，因为你的冻存袋和冻存夹也相当于一个隔离，按说就算液氮罐有菌也不能污染样本。

作者: shuimochunlan 时间: 2015-3-3 10:21

有可能是液氮罐内造成的污染，当然冻存前的操作过程以及复苏的过程中都可能造成污染

作者: mantianfeiyun 时间: 2015-3-3 10:45

我们实验室的冻存液是血清和DMEM单独过滤后和DMSO混合，DMSO不过滤的

作者: afei198520 时间: 2015-3-3 11:28

液氮罐内污染的可能性不是没有，但是可能性很小，基友可能是你冻存或者是复苏的时候某个环节发生了污染，平时细胞操作的过程中一定要注意保持良好的无菌操作习惯，对于冻存和复苏这样比较关键的步骤，配置试剂的时候最好是都滤膜过滤一遍再使用。

作者: baicaikua 时间: 2015-4-10 11:00

虽然液氮渗入冻存管有一定的可能造成污染，但概率很小很小，一般来说污染最大的可能还是冻存前和复苏后。

作者: leeky10 时间: 2015-4-10 11:29

冻存前污染的可能性是最大，相对来说，我要做复苏时都是格外的认真，在液氮中也有隔离，污染的可能性比较小，总的说来都有可能的，每个细节都要严格无菌操作的

作者: zhrt 时间: 2015-4-10 13:23

在复苏一管看看，排除下冻存操作下的污染及复苏的污染

作者: zhrt 时间: 2015-4-10 13:24

回复 rongcuizhen2005 的帖子0 e; Y: X) y9 n, E2 E3 S5 _9 p
' r! T: h* f& y' t+ `; F! U% g5 F
DMSO本身就是抑菌的呀

作者: iamzhangxiaoyu 时间: 2015-4-10 15:59

在没有保护剂的情况下，即使液氮里面有细菌也冻死了

作者: 伊诺强 时间: 2015-4-10 16:02

可能性不大！多数情况下是人为污染！用封口膜封好，复苏后酒精棉顺向擦拭冻存管口..........

作者: chenlin080102 时间: 2015-4-18 14:51

最大的风险可能是解冻的过程，所以最好解冻时候用赶紧的水，并且解冻后用酒精消毒冻存管

作者: daviddow 时间: 2015-5-27 17:17

不会污染。是你自己的原因。

作者: yuanyecat 时间: 2015-6-2 17:26

冻存的时候一般不会污染，但是你做冻存前处理或者复苏的时候是不是污染了

作者: wohuikude 时间: 2015-6-13 15:35

有可能是你在东存前就已经污染了，也有可能是在液氮罐中由于冻存管未拧紧，导致污染的

作者: 蜗牛爱贝贝 时间: 2015-6-16 10:04

1、如果冻存前已经检测了微生物实验，就基本上可以排除冻存经污染了
2、你们使用的冻存管质量，看看复苏完后，管子是不是有裂纹，在就是一复苏时尽量不要让冻存管全部浸入到水中，帽子部位尽量在水上表面& j* | |0 M7 R/ U4 L2 }- B3 A) }
3、复苏完后，第一遍离心或者取少量的冻存管细胞，做一次菌检、就可以很容易的判定是哪个环节出问题了
个人观点，液氮污染几率几乎为零，你想啊，-190度的温度，有什么细菌可以在不叫保护液的状态下，不被冻死，除了那一绝对绝对的极少数细胞，太少了，假如果真存在，在室温下，那就能生长，估计也悬

作者: 蔚海橙天 时间: 2015-7-14 11:54

首先，如果冻存前细胞检测或者培养没有问题，最大的可能是复苏的过程有问题，有一下几点在冻存过程中可以参考：9 M8 A! O( d3 t
1、冻存管的选择：冻存管一般有内旋盖和外旋盖，建议选择外旋盖，应用过程中可以减少污染情况。) w ^( e9 G9 t5 j. d
2、在冻存前可用封口膜，可避免解冻时的一些污染，还可以保护你在管壁上的标注不被酒精弄模糊。
3、解冻时，可以放在一次性薄膜手套里，在37度水浴中，防止解冻过程中，水浴锅里的不干净的水污染。
4、解冻后拿进超净台或生物安全柜前，喷究竟消毒冻存管和你的双手。5 O( J" [# o% q. N% z' q
其他操作同往常，应该可以避免一些污染的情况。

作者: iamzhangxiaoyu 时间: 2015-7-15 19:40

液氮肯定会渗入冻存管中的，如果会污染，那还怎么冻细胞

作者: yinjiaolian8679 时间: 2016-1-13 09:37

有一定的可能性，很多微生物在液氮中是没办法杀死的，而现在市面上的冻存管口为了适应温差，热胀冷缩的时候不至于爆管，都是无法密闭的。也有可能是你冻存时细胞就污染了或者是复苏时候某些细节不到位引起污染的吧

作者: 枫之叶影 时间: 2016-5-12 16:31

可能是冻存前或者复苏的时候污染的吧，现在的液氮灌都是气相的，相对来说出现污染的几率很低了

作者: 444352110@qq 时间: 2016-5-13 14:36

估计是从液氮中取出来以后污染的概率比较大！

作者: wf78365421 时间: 2016-5-13 15:11

基本不会

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