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标题: 单个核细胞分离无白膜层原因 [打印本页]

作者: zhuzhentulip 时间: 2012-12-13 21:45 标题: 单个核细胞分离无白膜层原因

我用15ml离心管分离5ml稀释全血（1：1）Ficoll分离液2.5ml，稀释全血与Ficoll分离液的比例是2：1，2000转20分钟离心，能得到较清晰的白膜层。后来我要分离50ml稀释全血的单个核细胞，分为4个15ml离心管分离，每管加Ficoll分离液2.5ml，稀释全血12ml左右，2000转20分钟离心，这样经常得不到白膜层，偶尔可以得到白膜层，是不是Ficoll分离液太少了啊？是不是Ficoll分离液与稀释全血的比例要1：1到1：2为宜呢？9 P5 M: \' h. m
如果用50ml的离心管来分离单个核细胞可以不，有人说液面大了分离效果不好，如果我用2支50ml的离心管来分离50ml稀释全血（1：1），每管25ml稀释全血，加到12.5mlFicoll分离液面上，Ficoll分离液与稀释全血的比例为1：2，2000转20分钟离心能得到较清晰的白膜层呢？

作者: meixue1130 时间: 2012-12-14 09:11

应该是分离液太少。我们一般用的是1：1比例的。
50ml 离心管可以用来分单个核，只要条件摸索好了，白膜层一样很清楚。你说的条件应该能得到白膜层。但是不同的离心机分离效果不一样，如果分离效果不好的话，你可以在这个条件附近进行变动得到最好的分离条件。

作者: easternliu 时间: 2012-12-14 09:46

我们就是用的50ml离心管，FICOLL：血 1：2。感觉分离的关键在加样和离心降速，加样要45度倾斜匀速，不要破坏界面，离心降速降到最低，高速停下来过程很重要。

作者: 莫邪小仙 时间: 2012-12-14 09:49

分离液2.5ml 全血就加12ml？！这个你买Ficoll的时候没有说明书吗？即使二者比例不是必须1:1 1:2 但是这个1:5的比例还是太小了点，一般的是1:2或者1:1.5 再者我们分离的时候是用的50ml的离心管，效果挺好，若是血量多，一下子八九十毫升用15ml的管得多浪费。。。。你说的那个方法可行，若是效果不好，可以提高离心力或转速 2500r

作者: Jonathan 时间: 2012-12-14 09:57

我们是用PBS来稀释全血，1:1. 然后每个15ml管里面加4ml的ficoll，然后加缓慢加血到15ml。一定要慢，才能形成很好的分层。这样保证没问题，屡试不爽

作者: lazyworm 时间: 2012-12-14 13:06

分离液确实太少了，血：PBS按1:1比例稀释，混匀后缓慢地加到同等体积的ficoll上。离心时间和转速可以根据离心后的效果摸索，比如说离心完后看到白膜层与血细胞层之间还是红红的，就可以提高转速或者多离几分钟，如果说离心后看到白膜层不厚，而且下面的液体也很清，就可以减小转速或者减少离心时间。

作者: zhuzhentulip 时间: 2012-12-16 21:09

回复 meixue1130 的帖子, f- S0 k7 s9 H+ S

谢谢你的回答

作者: zhuzhentulip 时间: 2012-12-16 21:11

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我们还是把减速设的0

作者: zhuzhentulip 时间: 2012-12-16 21:14

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实验技师给我们说的那样加Ficoll，但我在网上查了，也看了说明书，上面都是说的1：1或者1：2。所以就纠结了。

作者: zhuzhentulip 时间: 2012-12-16 21:16

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我明天就按12.5mlFicoll加25ml稀释全血用50ml离心管分离试试，我想应该可以的。

作者: zhuzhentulip 时间: 2012-12-16 21:17

回复 Jonathan 的帖子/ _. _" N: |' {2 H! y/ V

好的明天也试看看

作者: hwlightning 时间: 2012-12-17 10:39

50ml人外周血为例( U" z' |+ h6 O! r
先离心收集血浆，然后用DPBS稀释血液混匀至50ml
取两管Ficoll（天津灏阳）20ml/管，分别加入25ml稀释的血液，倾斜缓慢加入: R' j' P( {1 J7 M* e
800G 20min 升速和降速都为最小值

作者: zhuzhentulip 时间: 2012-12-17 22:46

回复 hwlightning 的帖子9 `8 u1 M# o0 B* n" y) z: Y
8 y$ H2 T# S1 y6 N; T! Q
我试过了，这样分离后白膜层很明显，谢谢你，我们还是用的Ficoll（天津灏阳）

作者: hwlightning 时间: 2012-12-18 07:29

回复 zhuzhentulip 的帖子

不用谢

作者: lyj-0017 时间: 2015-3-9 16:47

回复 hwlightning 的帖子
" p# U, k9 ?% I# q3 v
请问，采集的这50ml抗凝血是直接加入1支50ml离心管中离心收集血浆？还是分别加入多支50ml离心管，经稀释后再离心收集？转速设置多少不会对细胞有影响？谢谢！

作者: chenguangyu 时间: 2015-3-9 23:00

1.分离液太少，按1：2加。加时勿打乱分离液液面。: i& E- Y3 q4 P0 q, P
2.全血去血浆后多稀释一点。
3.加减速度调低一点。0 |4 }, @4 W" V7 M
4.可以选用50ml离心管。

作者: 312473313 时间: 2015-12-16 16:04

我们的是按血：PBS=1:1-1.5稀释，稀释后的全血缓慢地加到同等体积的ficoll上，我们一般用的50ml离心管2000转20分钟慢升慢降进行离心的可以参考下

作者: guanjun1314 时间: 2015-12-17 08:43

就是用2支50ml的离心管来分离就行了，Ficoll分离液与稀释全血的比例为1：1，2000转20分钟离心，这样就能得到较清晰的白膜层，也有个体差异的原因会出现不同清晰度的层次，但都会分得清的

作者: 吕小松 时间: 2016-4-27 15:38

回复 hwlightning 的帖子

请问收集完血浆，我用生理盐水1:1稀释血细胞混匀，然后缓慢加到Ficoll中，稀释后的血细胞与Ficoll的量是2:1，然后离心是2500rpm，30分钟，无刹车减速，分离后的白膜层可以看到，但是白膜层下面的ficoll层不清澈，有云雾状的东西，这是什么原因呢，我也是最近用的天津灏洋的ficoll，望解答！

作者: hwlightning 时间: 2016-4-27 16:51

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你Ficoll的量是不是少了一点，我们也用的天津灏阳的，现在天津灏阳科研级别的Ficoll分离效果变差了，所以我改用了临床级别的。
还有就是不同人的血分离效果也不同（特别是肿瘤患者）。其实这些对你培养细胞影响不会很大。

作者: 小刘 时间: 2016-4-28 08:42

离心参数太大，离不见了，或者离心力不够没分离开，看一下分离液有问题么，再看一下分的血各项指标都正常吗

作者: ybql 时间: 2016-4-29 14:50

回复 lyj-0017 的帖子7 j5 j7 a0 @8 N4 p2 e

50ml抗凝血，分两管每管25ml离心后去血浆，每管用PBS等体积稀释后，再用1：1-1.5的分离液离心

作者: Natalie 时间: 2016-5-5 13:04

可能是离心机的参数设置的不好，也可能是淋巴细胞分离液的比例太低了，最好1：1.25-1:1.5之间

作者: sky512829 时间: 2016-5-5 17:38

进来学习

作者: 淘知路遥 时间: 2016-5-9 08:56

我们是1:2，50ml血液不稀释，平均加到两个50ml离心管，分离效果挺好的

作者: kelinzjf 时间: 2016-5-9 17:06

用50ml离心管就可以了

作者: 小刘 时间: 2016-5-20 09:50

稀释时血液跟稀释液要大于1:1,稀释后的血液跟分离液也要大于1:1，并且不能破坏分离液液面

作者: 312473313 时间: 2016-5-25 14:14

FICOLL：血 1:1.5-1：2。注意加样和离心，加样不要破坏界面，离心慢升慢降

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