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标题: Realtime结果异常是SYBR不好么？ [打印本页]

作者: wuzhoulingxiao 时间: 2012-12-20 17:00 标题: Realtime结果异常是SYBR不好么？

这几次做的Realtime PCR实验，一开始用的是TAKARA公司的SYBR并以GADPH的引物实验，结果有Ct值是4或6的情况。但用了Bio-rad公司的试剂再重复就正常。如果用的是Actin B引物那不管用哪个公司的SYBR都有Ct值异常现象。请问大神是啥原因？

作者: 86964109 时间: 2012-12-21 09:28

回复 wuzhoulingxiao 的帖子
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你的异常是指Ct过早吗？是不是引物的问题呀，多做几套引物的比较一下呢？或者把模板稀释下

作者: wuzhoulingxiao 时间: 2012-12-21 16:17

回复 86964109 的帖子8 H2 t# E9 F6 f* S" U8 k

模板正常，因为每个样都做了2个重复，一个正常，一个异常。

作者: 86964109 时间: 2012-12-24 08:14

本帖最后由 86964109 于 2012-12-24 08:15 编辑
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回复 wuzhoulingxiao 的帖子" w: y, @8 F" R6 g/ T

你的模板是怎么加的？1μl的加还是稀释5倍后再加5μl？PCR重复性不好有可能是模板体积小，分布不均匀所致，不知道你的是不是这个原因。还有你的SYBR试剂都多久了，如果是新的应该没有太大问题才对，除非被污染了；另外仪器有校正过么？# r! m0 u7 Y' n' S7 m+ m

作者: wuzhoulingxiao 时间: 2012-12-24 11:51

回复 86964109 的帖子9 E) ]; n8 i: ~" R- P( @, i; B6 v

我的模板是按经验稀释20倍的，加1ul。SYBR是新到的TAKARA的，而且新开封，没有污染。

作者: 86964109 时间: 2012-12-24 15:15

回复 wuzhoulingxiao 的帖子3 J( { x' o. W. h }( j6 t

我不知道这种操作对你们来说是否是已经成熟的，不过仅就我的经历来说，即使我们拿2μg质量很好RNA逆转录出来的模板，直接稀释20倍取1μl去做PCR，结果也多是很不稳定的，模板中小分子团混的是否均匀，移液器的误差等等...

作者: sdyinong 时间: 2012-12-25 16:08

可以尝试不稀释试一试，也需要确认是不是仪器的问题，有的孔可能有问题

作者: lhmxm 时间: 2012-12-26 17:10

个人觉得罗氏的染料比较好

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