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标题: 病毒感染细胞问题 [打印本页]

作者: huangcong1988 时间: 2012-12-30 08:52 标题: 病毒感染细胞问题

收集病毒以后，用100KD浓缩柱子浓缩，大概能浓缩10~15倍，一般就是15ml病毒上清能浓缩到1~1.5ml，浓缩后的病毒感染成纤维细胞发现，在4×的荧光视野下完全看不到荧光，但在10×视野下能看到微弱荧光，我是用的六孔板，一个孔里面加300μl浓缩后的病毒夜，为什么感染效率这么低？我还加了polybrene，浓度为10μg每ml。病毒滴度应该不很低啊，因为当时收集完病毒之后，照过荧光，很亮。感染过293T，也还是比较亮。为什么感染成纤维就不亮呢？

作者: varing 时间: 2012-12-30 09:59

感染原代细胞本来就比较难。我现在也是这个问题，48小时后在20×的视野下才能看到荧光，293太容易感染了。我的没浓缩，很大的原因是病毒滴度不够，也可能是MEF状态不好。我打算把细胞铺稀点，然后多次感染来克服。

作者: yueweilei 时间: 2012-12-30 23:51

呃，想问下用的什么病毒啊？用来做iPS？6 Z" o7 _$ P3 S' H" S# h

作者: huangcong1988 时间: 2013-1-2 09:38

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滴度不够的话，浓缩了啊，用浓缩柱浓缩了，浓缩后的病毒，加的量还不少，再感染，结果也还是不好

作者: huangcong1988 时间: 2013-1-2 15:56

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恩，是的，慢病毒

作者: yueweilei 时间: 2013-1-2 19:38

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哦。我们用的逆转录病毒。不过，慢病毒好像可以通过高速离心1h-2h，进行浓缩。

作者: huangcong1988 时间: 2013-1-2 21:14

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逆转录病毒系统我也有一套，不过逆转录病毒的没带荧光，只有一个control。我用柱子浓缩，你逆转录病毒感染效果怎么样呢？

作者: yueweilei 时间: 2013-1-2 22:28

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我用12孔板做，每个孔一般能有二十个左右的ips克隆形成，应该还行吧！

作者: huangcong1988 时间: 2013-1-3 13:10

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多久形成colony？还有你病毒加入量是多少？

作者: yueweilei 时间: 2013-1-3 15:42

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没测滴度啊，不知道具体是多少。四因子的话大概十几天吧。

作者: 小时候就很酷 时间: 2013-1-5 19:19

细胞状态和病毒活性也很重要，你转染时时间不能过长也不能太短，最好是傍晚转染，然后早晨收细胞。一定要把握好时机。

作者: huangcong1988 时间: 2013-1-7 22:00

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我知道，那你包完毒以后，加入到感染细胞中，总有一定体积吧？

作者: yueweilei 时间: 2013-1-8 13:36

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2ml/孔

作者: huangcong1988 时间: 2013-1-8 15:49

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直接用10cm dish包毒，然后病毒液不浓缩，收集的病毒液直接感染MEF，6孔板，每个孔2ml病毒上清是吧？这样细胞不会死亡吗？应该会大量死亡吧？还有一个问题，加了polybrene没？

作者: spongezhao 时间: 2013-1-9 11:00

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请问是MEF铺稀点吗？如果是的话密度铺多少呢？感染多次会不会造成细胞的大量死亡呢？

作者: yueweilei 时间: 2013-1-9 22:30

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加了。细胞没死。12孔板！total 2ml。其它的你自己摸下条件吧！

作者: 细胞海洋 时间: 2013-1-9 22:30

回复 spongezhao 的帖子1 p6 }* _+ o1 R7 r3 u. m- P/ w3 s7 I
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作者: varing 时间: 2013-1-10 21:05

回复 spongezhao 的帖子
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是的 MEF可以铺稀少点因为多次感染过程中细胞还会长一些的多次感染会有细胞死亡我发现有的地方是成片死亡就一块地方细胞裂解一样好的地方和死亡的地方界限分明

作者: huangcong1988 时间: 2013-3-31 19:31

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您是二十几天以后才出现colony是吧？那之前细胞形态那些有没有一些变化呢？就是细胞出现聚集的情况？我发现孔板周围的细胞，可能是feeder已经出现脱落了，怎么办呢？

作者: yueweilei 时间: 2013-4-2 13:50

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不是感染成纤维细胞吗？怎么会有feeder啊？我的是加病毒没几天，细胞形态就发生变化了。但是成为克隆要十几天！

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