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标题: 关于神经干细胞的培养请教 [打印本页]

作者: 86964109 时间: 2013-1-3 11:04 标题: 关于神经干细胞的培养请教

本帖最后由 86964109 于 2013-1-3 11:05 编辑 % ~9 Q- o; _8 S/ E( P
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大家培养神经干细胞用的是商品化的完全培养基还是自己配的比较多呢，一般培养一瓶细胞需要取几只孕鼠？以下是查了一些资料后设计的实验步骤，请大家帮忙看看可行吗，有什么格外需要注意的细节吗？. P; P% B) b% F' |/ l9 K
(1)取孕14.5天SD 大鼠 ,引颈脱臼。在无菌状态下剪开腹部皮肤及肌肉，取出胚胎置入D-hank’s液中。$ p0 `1 k6 e$ C1 q1 G& U0 D6 [, ~
(2)逐个仔细分离出脑组织置入D-hank’s液中漂洗，剥离脑膜及血管,分离出海马,剪碎成约0.2mm×0.2mm大小的碎片。
(3)加无血清的神经干细胞培养基 [组分为DMEM/ F12 (1∶1) 、N2(10％) 、20 ng/ ml bFGF、20 ng/ ml EGF 、1%双抗]，以Pasteur管轻柔吹打成单细胞悬液,再加少许细胞培养基于离心管，以获取更多细胞。, K! v d) f4 `* d Q
(4)台盼兰染色后计数，以1 ×106/ ml 的活细胞密度接种于培养瓶中。 37 ℃、5 % CO2 孵育,倒置相差显微镜观察。
(5)细胞每5－7天传代一次，收集神经球，以神经干细胞培养基重新制成单细胞及小细胞团悬液，以1 ×106/ ml 的活细胞密度传代。

PS：还有神经干细胞的培养一定要经过自新能力鉴定、nestin 表达的鉴定和多向分化能力的鉴定吗？
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谢谢啦

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-1-3 15:25

回复 86964109 的帖子& d8 Z. V- S9 Z$ Y7 V5 l- B1 o+ a& b; _' o

我们用的是出生后3天内的小鼠，（1）先浸入络合碘淹死，然后再剪开头颈部皮肤、头颅骨，最后取下海马区，第（2）步同上，（3）培养基成分：没有加双抗和细胞因子。有谷氨酰胺。第（5）步，视细胞是否形成神经球定多久首次换液。神经干细胞鉴定尚缺经验。多多交流

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-1-3 15:26

是大鼠，写错啦

作者: 86964109 时间: 2013-1-4 08:10

本帖最后由 86964109 于 2013-1-4 08:11 编辑

回复湖南干细胞的帖子

谢谢分享不加双抗，那你们的培养环境和无菌操作一定很好

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-1-4 09:05

回复 86964109 的帖子

更正：我们实验室的培养基中的细胞因子还是加了，没有加N2、双抗，加2%的B27。这方面的可以参照一下http://www.dxy.cn/bbs/thread/4477690

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-1-4 10:50

回复 86964109 的帖子 v' z5 r6 [ D

培养基的成分更正：含2%B27,不含N2和双抗，含细胞因子，浓度同上。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-1-4 11:15

回复 86964109 的帖子

我们实验室经常用β-Tublin免疫荧光检测，实际上要测定需要做包括形态学、表面标志物等很多检测。不知道怎么传图片，附下文链接。为神经干细胞鉴定要求http://www.stemcell8.cn/home-spa ... ward-1-id-1539.html

作者: 86964109 时间: 2013-1-7 13:07

回复湖南干细胞的帖子3 T, x5 C; Q8 d7 H
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谢谢，学习了，先看看能否分出来吧有问题再请教

作者: 小渝 时间: 2013-1-10 21:19

自己分离培养肯定需要鉴定，当然是所有都鉴定更好了但是肯定得根据实际情况来选，我们是免疫荧光鉴定nestin，现在很多都是鉴定SOX2这样。另外我个人觉得如果没有解剖显微镜你要分离脑组织然后剥离海马是很不现实的事情。另外就是可能杂细胞会多，单纯机械吹打可能会因为力道问题损伤细胞严重。可以试着用用胰酶替代物进行消化结合轻柔的机械吹打。

作者: 86964109 时间: 2013-1-11 15:32

回复小渝的帖子
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谢谢指教，那么如果从全脑组织分离培养干细胞不可以吗，传代过程中不能纯化吗？有人用注射器推打分离细胞，请问可行吗？

作者: 小渝 时间: 2013-1-11 17:30

回复 86964109 的帖子
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个人愚见而已，如果全脑的话理论上是孕期越早越好，可能就涉及到胚胎干细胞了，不同部位取神经干细胞文献是有个推荐的相对合适时间的，nature protocols上有。关于注射器推打分离细胞这个方法因为看文献少没有见过，很感兴趣呀，不知道楼主能否提供相关的文献或出处呀？非常感谢了！

作者: 86964109 时间: 2013-1-15 09:42

回复小渝的帖子
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抱歉才看到帖子，具体文献我一时也找不到了，是提神经干细胞还是神经元的也忘了，就是记得在丁香园还是哪里看到有人提到过，在英文文献里好像也见过，还提过什么规格的注射器

作者: menlady 时间: 2013-1-19 13:44

我想问一下，神经干细胞培养几天换液啊，悬浮生长的细胞球换液时会被吸引器吸走吗？

作者: 细胞海洋 时间: 2013-1-20 22:31

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作者: bibottll 时间: 2013-1-22 18:17

我们用的是GIBCO的商品化培养基，neuralbasal，一瓶六百左右，但我们主要养的不是成体神经干细胞，是从胚胎干细胞诱导分化的，成体的用这个也是没问题的，我养过

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