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标题: 磷酸钙沉淀方法进行逆转录病毒的包装问题 [打印本页]

作者: 2006sw0657 时间: 2013-1-12 14:51 标题: 磷酸钙沉淀方法进行逆转录病毒的包装问题

磷酸钙沉淀方法进行逆转录病毒包装时，最后一步骤加入2乘HBS时，半小时之后，出现白色絮状沉淀，以前半小时之后出现的是混悬液，无明显白色絮状沉淀出现，化学试剂都是现配的，PH也问题不大，请大家告知一下怎么会出现明显白色絮状沉淀？质粒也是最近才抽提的！很头痛 :'(

作者: 希望之光 时间: 2013-1-13 09:14

所用试剂全部要用0.22的滤器滤过的！水很关键！如果这些都做到的话，那就要考虑两种情况，试剂配制和污染!

作者: 刘森泉 时间: 2013-1-13 21:41

你试下这个：百恩维生物科技有限公司高效转染试剂盒（HET）Cat No：BW11002，也是磷酸钙的方法，便宜。使用效果不错。

作者: 刘森泉 时间: 2013-1-13 21:41

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你试下这个：百恩维生物科技有限公司高效转染试剂盒（HET）Cat No：BW11002，也是磷酸钙的方法，便宜。使用效果不错。

作者: wangcs 时间: 2013-1-14 11:19

我们用的是碧云天的磷酸钙转染试剂盒（Cat No：C0508），效果不错的！（不是广告啊！）

作者: wangcs 时间: 2013-1-14 11:20

补充一下，效果很好！

作者: franklinhg 时间: 2013-1-14 20:09

其实很简单的磷酸钙形成过程中你没有把CaCl2和质粒形成的混合物与2XHBS溶液完全混合均一。还有就是一旦与HBS混合均一后，我一般是只放2-3分钟然后就均匀加在包装细胞表面去了，12-16小时候换液。实验效果都还不错，一般保证在90%的效率。

作者: franklinhg 时间: 2013-1-14 20:13

白色絮状沉淀那个是形成的混合物颗粒太大导致的主要原因是没有混合均匀一般是在漩涡仪的最大档上 15毫升离心管里盛HBS 然后以200微升的微量移液器一滴一滴的加入已经混合均一的CaCl2和质粒的混合物。

作者: daviddow 时间: 2013-1-14 23:18

用0.45um的滤器过滤的

作者: wnavy200299 时间: 2013-1-15 23:04

回复 2006sw0657 的帖子- x5 s+ h f: k- x
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我们经常做这个，很简单，楼上的朋友说是没有混匀，我觉得倒没必要用vortex去震荡混匀，而且也不怎么方便。我们一般用peptte来回混匀几下（3~5下），就ok了，然后室温静置15min（没必要30min，反而不好！易形成絮状！！！！）。然后加至细胞板中！另外有的细节注意一下，就是最好用质量好点的CaCl2，我一直用sigma的（转染试剂已经省了，这个就不要节省了！哈哈~~，有一次我错用了fisher的cacl2，感觉效果不好！）。个人意见，仅供参考！祝你好运！

作者: wnavy200299 时间: 2013-1-16 22:45

回复 2006sw0657 的帖子1 P( M4 l/ z* g0 }/ s

另外，忘说了，你应该知道的，就是配置好的CaCl2是需要用0.22um小滤器过滤，毕竟是转细胞嘛，当然是的无菌了。其他试剂也一样，都要保证无菌啊，什么自己弄得ddH2O。

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