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标题: 质粒酶切检测如何选择酶切位点？ [打印本页]

作者: kephort 时间: 2013-1-13 00:42 标题: 质粒酶切检测如何选择酶切位点？

现在在提取的有4种质粒，每种都挑了2-3个克隆，请问怎么进行酶切鉴定啊？$ w1 T: G5 N$ c7 q4 O% _
选择单酶切和双酶切要注意什么？如果做PCR检测，引物是选哪个区段呢？什么情形下要做测序？

作者: 军医 时间: 2013-1-13 08:45

双酶切注意：1.两个酶的反应温度是否相同，不同的活就要分两次酶切
                  2.注意内切酶是否是对甲基化敏感，有的酶需要用GM110这样的菌株转化，得到的质粒才能被切开。4 }+ Y+ x3 P0 ~9 J( o
                  3.两种酶是否有公用的buffer，无公用的buffer的话就要分两次切了。) m. J3 [) @# l. O7 a. @; k+ K- E# H
                  4.不要把目的片段切开，无论是双酶切还是单酶切都要选在质粒上有单个酶切位点的内切酶。
                  5.单酶切和双酶切最好都做，保险。
PCR检测： 1.引物一般设计在插入片段两侧，如果是别人给的商业化质粒，最好在用测序引物测下多克隆位点，防止多克隆位点有突变。% h2 L2 v( p8 V
                  2.如果是插入片段的话，最好测序鉴定一下。PCR产物只看大小就能确定了。/ I1 _4 K9 e8 [2 m; b0 H8 p! k' A

作者: mzaq2006 时间: 2013-1-13 22:25

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那请问你知道miRNA的引物怎么设计的吗

作者: 86964109 时间: 2013-1-14 08:10

本帖最后由 86964109 于 2013-1-14 08:10 编辑 ) ^2 `6 H/ H& E4 m

回复 mzaq2006 的帖子& }0 Z, t, k9 v+ X

有茎环法和加A法，一般用茎环法比较多可以参考以下文献

Real-Time PCR Quantification of Plant miRNAs Using Universal ProbeLibrary Technology.pdf (219.14 KB)

附件: Real-Time PCR Quantification of Plant miRNAs Using Universal ProbeLibrary Technology.pdf (2013-1-14 08:08, 219.14 KB) / 下载次数 22
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NDg4NjV8MDJkYjMwZWN8MTc5MzcxNDUzN3ww

作者: goast8 时间: 2013-1-14 10:04

一般情况下，怎么插入怎么酶切鉴定就可以了。2 m5 `2 m6 }/ s& X) D; O( U
如果是特殊方法插入，无法用插入的双酶切鉴定，可以用插入片段外部的酶进行酶切，这时可能需要你对载体及你的插入序列有完整的信息。
现在分子克隆的常用酶，基本双酶切组合都没问题。也可以考虑快切酶鉴定，10多分钟就可以。0 H0 y/ N' V9 J( x
pcr检测一般也用你之前克隆时设计的引物进行就可以了。一般情况下都是要测序确认的。

作者: mzaq2006 时间: 2013-1-14 21:50

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. E' h0 P d5 o% G: ]# F- D9 ^
非常感谢您的回复。我自己也了解到，茎环法涉及3条引物，一条是RT引物，一条是正向引物，一条是反向引物，一般都用的是通用引物，我有个问题是，反向引物是否可以针对不同的miRNA而设计特异的引物呢？什么情况下需要这样做呢？就是说，你必须要设计特异的反向引物。希望能得到解答，谢谢。

作者: 86964109 时间: 2013-1-15 08:12

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: x& b6 H" ~9 H) |) G0 |
应该一般是不用的，因为反向引物对应的是RT引物上通用的序列部分，退火条件如果和正向引物能匹配，基本上是不用换的，不过如果说和正向引物错配实在太多的话，可能需要考虑一下

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