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标题: 传代后细胞这样怎么办？ [打印本页]

作者: fay898 时间: 2013-2-15 00:50 标题: 传代后细胞这样怎么办？

人骨髓间充质干细胞，第一次传代已经7天了，细胞长的很奇怪，求解！！！
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里面大大圆圆的是什么啊？？？是MSC么？细胞还要留着么？！
望各位指教哈！！

作者: cherrysung 时间: 2013-2-15 04:22

这是原代细胞第一次传代？什么来源？

作者: 孙帅帅 时间: 2013-2-15 09:16

里边圆圆的肯定不是间充质干细胞，间充质干细胞是成纤维状贴壁细胞，胰酶消化后看到的才是圆形的细胞。原代培养的怎么样？你是用什么方法处理的脐带啊？是不是支原体污染？

作者: 猩猩 时间: 2013-2-15 09:53

你在传代后有换液么？？？你在移动培养皿的时候，圆点是否也移动？？你确定圆点是贴壁生长了么？？若没有贴壁的尝试下用培养液冲洗掉

作者: yinfuhua 时间: 2013-2-15 10:15

回复 fay898 的帖子( }2 j# Q) i7 W

原代生长如何？现在细胞的状态不好，感觉再培养下去也没什么意义了。骨髓间充质干细胞原代培养时生长较为缓慢，传代后生长会快些。传代时要注意细胞密度（照片上看你的密度太低了），3d左右即要根据情况换液，注意无菌操作，保持良好的生长环境，细胞才能长好。

作者: fay898 时间: 2013-2-15 13:39

回复 cherrysung 的帖子. \( B: K$ L* @# e5 B# \8 j

对的，是第一次传代。人骨髓间充干~

作者: fay898 时间: 2013-2-15 13:41

回复孙帅帅的帖子 m- Z1 w7 }2 h$ X2 ^1 e5 F3 d
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我用的人骨髓，Ficoll分离后直接培养。培养液中有1%的双抗。原代MSC簇有点老化，养了20天才传第一代~~~纠结了~~~

作者: fay898 时间: 2013-2-15 13:43

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这是刚刚全量换液后的照片。细胞传代后已经换了1次液了，这是第2次换液。移动培养皿时，原点不动的~~没敢冲洗~~下次换液我试试~~

作者: fay898 时间: 2013-2-15 13:56

回复 yinfuhua 的帖子/ y9 g# Q6 b! }# |! @6 c
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谢谢您！原代接种了2皿，长的比较慢，虽有MSC簇，但比较少；22天第一次传代，细胞很少，细胞簇中间有点老化；2:1传至10cm皿，已经换液2次。麻烦请教下，初次接种密度多少为宜？！

作者: yinfuhua 时间: 2013-2-15 15:04

回复 fay898 的帖子, {$ v' u- G1 h& ?; e: ^
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不客气。一般初次接种密度大约在2-3X10^6次方。你原代培养时间过长，所以老化严重。如果看细胞数量不多，甚至可以1:1传下代，然后继续培养、换液。再根据细胞生长状况决定下一步的传代。你试下看看，这样会好些的。

作者: fay898 时间: 2013-2-15 15:31

回复 yinfuhua 的帖子5 j' s2 d T, e! d. e4 v' i/ X
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谢谢！

作者: monk125 时间: 2013-2-15 17:54

学习下

作者: deshenglll 时间: 2013-2-16 09:15

是不是接种数量低了

作者: jxydiandian 时间: 2013-2-16 09:18

我们老师说圆圆的是破骨细胞，随着传代次数的增加，破骨细胞会越来越少，间充质会越来越多！不过你传代的接种密度太稀了吧！

作者: 小冬子 时间: 2013-2-16 10:05

你这个细胞密度太小了！这样传完细胞长时间不铺满一层很容易分化的。看图片上的细胞形态，已经分化了。。。

作者: bsx1111 时间: 2013-2-16 12:22

细胞严重老化，如方法没问题，是不是考虑骨髓本身的问题，骨髓间充质干细胞会随着人年龄的增加增殖变得缓慢，建议做一些年轻的骨髓在试一试

作者: xiaolong 时间: 2013-2-16 13:23

可惜啊，7天了都，传代时密度要控制好，你这个密度太低了，细胞不好增殖，容易老化

作者: 漂泊的风 时间: 2013-2-16 14:05

这个细胞状态肯定不行了，我建议你赶紧丢弃，重新制作，要不是浪费时间。

作者: jensn 时间: 2013-2-16 14:09

从突变上看，细胞的密度比较稀少，同时形态也不是很典型。个人觉得是长得不好的细胞无法贴壁后皱缩成的细胞碎片。只不过如果你晃动的时候也未见圆点移动，有点奇怪。

作者: 暖羊羊 时间: 2013-2-16 14:27

回复 fay898 的帖子

从照片上看MSC细胞量很少，并且状态也不佳。请问原代的状态怎样呀？
我想可能是由于两方面的原因：一是原代状态不好，细胞量也不够；二是传代后细胞还没有完全贴壁就急于第一次换液，导致目前的细胞量更少。+ S1 n& Q! X+ L, w
可以确定的是中间的大圆不是MSC（因为MSC是纤维状的），可能是细胞液中的杂质，认为目前的状态已经没有了留下来的意义，如果空间足够可以放置于CO2培养箱中观察一段时间。

作者: fay898 时间: 2013-2-16 17:54

回复 jxydiandian 的帖子

请问下传代后的接种密度多少啊？！

作者: fay898 时间: 2013-2-16 17:55

回复 deshenglll 的帖子

请教下传代后的接种密度多少啊？！

作者: redmoon610 时间: 2013-2-16 18:10

细胞已经有些老化了，正常形态应该是细长梭形。这个做个成脂诱导吧，作为下一步写文章中得鉴定使用。

作者: lvsuperman 时间: 2013-2-16 18:28

圆圆的飘起来的是不是死细胞，密度似乎小了点，下次传代换小孔板叫胞胞们密集点看看

作者: jxydiandian 时间: 2013-2-17 09:16

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1*105/ml左右

作者: 孙帅帅 时间: 2013-2-17 11:00

回复 fay898 的帖子

我们养的是脐带间充质干细胞，原代培养7~9天就要换液重铺，当细胞贴壁率在80%以上时，才传第一代，一般就是3天左右吧！你是用的什么培养基啊？

作者: fay898 时间: 2013-2-17 21:23

回复孙帅帅的帖子2 q8 B) O4 t- W) S6 m
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骨髓长的比较慢，原代培养15天左右才能传第一代~现在用维森特的低糖DMEM+10%南美FBS+1%双抗~

作者: yezi_830823 时间: 2013-2-17 23:10

你可以消化一下把消化的细胞再传代培养，用小点的培养皿试试。

作者: 老姜 时间: 2013-2-18 02:03

消化后的细胞传代接种细胞密度至少应在6～8x103/cm2,低于此接种密度细胞细胞不易长起来，尤其原代细胞收获的少，按此数不够一个10cm皿的接种数可将细胞接种于6cm的皿中，待4～5天细胞扩增的汇合了再按此密度往大皿里传，这几张图的细胞种的太稀，7天才长成这样，养十几天即使细胞长的汇合了，细胞的质量也不能保证。

作者: fay898 时间: 2013-2-18 10:20

回复老姜的帖子
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恩，下次注意改进！谢谢您！

作者: xuehu20 时间: 2013-2-18 13:56

你的细胞明显是长老了，原代培养时间太长了，而且细胞好稀啊，如果细胞数量少的话你可以适当的将培养瓶换成更小的试试

作者: fay898 时间: 2013-2-18 15:42

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好的~下次会注意的~谢谢~！

作者: keekeetiger 时间: 2013-2-20 00:26

细胞明显老化了。建议开始培养的时候，细胞不要太稀疏，可以先拿25cm小培养瓶的或者6cm的培养皿培养，等细胞长出来后，达到80~90%融合时，再进行传代，开始可以按1:2进行传代。

作者: dongxin 时间: 2013-2-20 09:13

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骨髓间充质干细胞应该是呈梭型的，核浆比大，看你的细胞应该是细胞密度太低导致的，我养脐带间充质时就因为细胞密度低，出现过这样的情况。

作者: nydfy 时间: 2013-2-20 10:01

可以扔了，细胞已经分化或老化了，绝对养不起来的！我觉得你可以从你的培养基入手，我用的medium是：L-DMEM(含Glumax的，GIBCO)+10%FBS(GIBCO)+庆大霉素（50ug/ml），这个细胞很好养，生长速度也很快，1:3传代，一般3天可以长到90%以上，希望对你有帮助！

作者: fay898 时间: 2013-2-20 19:33

回复 nydfy 的帖子

谢谢您！查阅文献时也发现推荐加GLUMAX，对维持细胞形态有好处，但我目前没有~~哎~~我只能在操作上改进咯~~

作者: fay898 时间: 2013-2-20 19:34

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恩！领教了！谢谢您！

作者: sjlzw 时间: 2013-2-24 21:11

会不会是消化过久？

作者: 流云阿凯 时间: 2013-2-25 21:02

原代MSC有点老化了，圆圆的边缘就可以看出来，你要重新分离培养了，密度适当大点，可以避免这种情况。

作者: 漂泊的风 时间: 2013-3-12 09:08

我觉得你这细胞长不起来的，密度太低了，另外状态也不是太好，建议重新做，别浪费时间了

作者: 帝国黑骑士 时间: 2013-3-12 12:49

你这个细胞密度太低了！不一定能长起来！不过你可以再养养看，实在不行就消化掉重新贴壁试试看！细胞密度低的话，形态是不太好，但是要是能张起来的话就回看起来好很多的！加油！

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