本帖最后由 细胞海洋 于 2013-2-21 11:34 编辑 5 g/ P+ D4 X# R6 ` 4 o/ N# V$ u+ P: W回复 孙帅帅 的帖子 . z, R- x q+ Q5 J3 p7 R5 P6 F, P: U" s0 ]& d9 t; Z
无血清培养基与完全培养基体外诱导扩增 CIK细胞! W/ C/ B! x/ b$ b4 e! h
' h% z8 ]/ z1 {) M+ g
【摘要】 目的 比较无血清培养基（AIMV）与完全培养基（CM）体外诱导扩增CIK细胞及CIK细胞分泌细胞因子水平。方法 分别用AIMV及完全培养基加入4种细胞因子(IFNγ、IL2、IL1及OKT3)将脐带血单个核细胞(CBMNCs)诱导成CIK细胞，比较细胞的增殖能力、细胞表型及分泌细胞因子水平。结果 与完全培养基比较，无血清培养基培养的CIK细胞增殖高峰较晚(14～17天),但增殖倍数高，在细胞表型、分泌细胞因子水平方面两种培养基培养的CIK细胞均无明显的差别（P＞0.05）。结论 无血清培养基可代替完全培养基。 3 l" J/ f2 d. h( \ f4 x- O1 C9 |6 i【关键词】 无血清培养基 免疫 细胞培养 细胞因子 肿瘤 : M: d+ q) Z0 d( e) Q/ ^
0 引言 / K5 F" t5 y: ~CIK细胞（Cytokineinduced killer，CIK）是将人外周血单个核细胞，在体外用多种细胞因子（如IFNγ、IL2、IL1及OKT3等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。具有极强的增殖能力及杀伤肿瘤细胞的能力。Critzapis等[1]报道，CIK细胞分泌多种细胞因子进一步提高免疫效应细胞的细胞毒作用从而杀伤肿瘤细胞。治疗所需的CIK细胞在体外培养时所用的条件对细胞的活性有很大影响。现在常用于细胞培养的完全培养基,因含有人AB血清,虽经HBV、HCV及HIV的检测,但仍有可能传播其他疾病,安全性低;并且存在批次差异、不宜质控，质量不能保证。无血清培养基则可达到生物洁净要求,成分明确,质量稳定,便于质控,克服了人ＡＢ血清的缺点,能减少病人意外感染的机会，对于免疫治疗的推广应用有重要意义。为此,我们比较了无血清培养基（ＡＩＭＶ）与完全培养基(含10%胎牛血清RPMI 1640)培养CIK细胞分泌细胞因子水平。 3 o5 K2 F1 \; ]* q3 \1 材料与方法 2 ~1 y* X7 |$ N) a2 Q2 Z- K' h( p0 {1.1 材料 * z/ H. t3 }" f$ V2 R健康足月产胎儿脐带静脉血50ml(枸橼酸钠抗凝),产妇各项生化指标检测正常。RPMI1640培养基、淋巴细胞分离液和无血清培养基购自GIBCO公司,细胞因子购自Bioscience公司, 流式试剂CD45FITC/CD4PE/CD8ECD/CD3PC5、CD3FITC CD16+CD56PE和PI染液购自BeckmanColuter公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司。 : U' n; Y1 i3 M6 m- P
1.2 方法 : u8 F+ D) h- u( f; |1 r1.2.1 细胞培养 7 V, E! Z6 ^9 C; s% k9 n9 ~脐血用淋巴细胞分离液作密度梯度2500r/min离心30min分离的外周血单个核细胞, 分别用完全培养基(RPMI 1640,含10%胎牛血清,100μｇ/ｍｌ链霉素,100Ｕ/ｍｌ青霉素)和无血清培养基调整细胞数为1×106个/ml,接种于24孔培养板,930μl/孔。第1天加入rhIFNγ 1 000u/ml,培养24h后加入rhIL2 300u/ml、rhIL1 100u/ml及OKT 350ng/ml继续培养,每隔4d更换培养基,调细胞数为1×106个/ml,补加rhIL2 300u/ml,每8d在补加rhIL2的同时补加OKT 350ng/ml。YTMLC、GLC和A549用含10%的胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640常规培养。设不加细胞因子的CBMNCs培养作为对照。 $ x8 @( V! h- J6 s, `
1.2.2 细胞表型分析 3 w r1 I0 w1 }& |; \# ~, J; w8 D1 o
于培养的第0、4、8、10、12、14、17、21d对以上各组效应细胞进行分析,每组每次测4个复孔。 9 x% ]0 m% Q3 _8 [& |1.2.3 细胞增殖能力测定 I7 B4 H; c2 O, \- z
于培养的第0、4、8、10、12、14、17、21d分别取细胞用台盼蓝拒染法计数所培养的活细胞浓度,根据流式检测的CIK的比例，计量液量,推算CIK细胞总数。 8 C( r' `/ G, ?9 u% r0 o5 A
1.2.4 CIK细胞分泌IL2、IFNγ、TNFα细胞因子水平测定 % O7 S1 G. |7 l0 u
于培养的第0、4、8、10、12、14、17、21d分别取细胞,充分洗涤,调整细胞浓度为2×106/ml培养24ｈ后,收集上清,用ＥＬＩＳＡ法定量测定细胞培养上清中IL2、IFNγ、TNFα，设4个平行孔。 3 j" }5 J# |5 \8 a/ ~2 结果 , N9 e$ |) k, i' u0 x" P
2.1 ＡＩＭＶ与完全培养基培养CIK细胞增殖能力的比较 1 M$ L2 W0 O+ ^7 V实验表明,ＡＩＭＶ培养细胞较完全培养基培养细胞增殖迟缓。完全培养基增殖高峰期在第12d，增殖平台为第10～12d，最高增殖倍数为638.4倍；而ＡＩＭＶ培养基增殖高峰期在第14d，增殖平台为第14～17d，最高增殖倍数为678.7倍。虽然ＡＩＭＶ培养细胞较完全培养基培养细胞增殖迟缓，但其增殖平台期较长，增殖倍数较完全培养基高，见图1。 ; U. ]" n8 }) D5 e, }; T3 Y2 r图1 AIMV与完全培养基培养CIK细胞增殖能力 0 x: A5 n( S" t$ `' w; X
2.2 ＡＩＭＶ与完全培养基培养细胞表型比较 2 b2 B( T q; Y' o实验结果表明，两种培养基培养的细胞CD3+、CD8+、CD3+CD56+细胞所占百分比逐渐增多，CD3+CD56+细胞在ＡＩＭＶ培养基中，增长高峰在14～17d，所占相对百分率由（0.21±0.04）上升为（31.53±1.65）,增长了150.14倍，完全培养基增长高峰在12～14d，所占相对百分率由（0.21±0.04）上升为（30.90±2.28），增长了147.14倍。对照组CBMNCs培养体系中未出现明显的细胞表型转化,各种细胞成分均呈递减趋势，见表1、图2。 ' q1 C+ ?, T. w1 s- z( T
2.3 AIMV与完全培养基培养的CIK细胞分泌细胞因子水平 9 W5 \# K, q& F/ ^% o6 U+ h( E1 V
2.3.1 IL2水平 % z! _* u P {# p# E
AIMV与完全培养基培养的CIK细胞均分泌IL12，从第4d分泌量均稳定升高，都于12d达到高峰，第14d略有下降为，以后逐渐下降。但AIMV培养基第12d的IL2水平（222.525±19.889）pg/ml明显高于完全培养基培养组（189.075±6.343）pg/ml，且下降水平也慢于CM组，见图3。 ; W7 _) R9 ]2 n6 N$ _0 y+ j3 pA：培养前；B：完全培养基培养后；C：AIMV培养基后表1 ＡＩＭＶ与完全培养基培养细胞不同时间的表型变化 7 ~0 p" c R0 f" e2.3.2 IFNγ水平 0 T4 B1 C5 o! u9 d
AIMV与完全培养基培养的CIK细胞均分泌IFNγ，在第4d IFNγ水平开始升高，第14～17d分泌量增大，完全培养基培养组第17d达到高峰为（246.854±4.758） pg/ml，而AIMV组14d达到高峰（227.88±3.048）pg/ml，高峰期后均迅速下降，见图4。 6 l/ k/ r4 N! Q# E" u2.3.3 TNFα水平 / d+ ~" P/ e! V i
AIMV与完全培养基诱导培养的CIK细胞均分泌TNFα，第4～17dTNFα水平均平稳升高，完全培养基组第17d达到高峰为（247.032±9.117） pg/ml，第21d略有下降为（186.953±3.815）pg/ml，而AIMV组14d达到高峰为（222.53±8.965）pg/ml，之后TNFα水平开始下降，见图5。 % {5 [! q# j5 {4 Z3 讨论 & }7 o1 i( M" PCIK生物免疫治疗已作为肿瘤综合治疗中的一种重要手段，能清除恶性肿瘤患者术后、放化疗后微小残留病灶及调节患者的免疫能力。但现在用于CIK扩增培养的培养基一般为AB血清培养基，但人ＡＢ血清存在安全性低,不宜质控等缺点,无血清培养基正得到越来越广泛的应用。多数研究表明,无血清培养基可代替含血清的完全培养基,二者所得培养物的数目和功能相当[24];但也有不同的观点,认为应用无血清培养基所得细胞功能受到损害[5,6]。无血清培养基ＡＩＭＶ是美国Ｇｉｂｃｏ公司专为体外培养淋巴细胞设计的产品,可用于临床试验。因为人ＡＢ血清存在个体差异、质量不稳定等诸多的不确定因素,因而我们选择美国Ｇｉｂｃｏ公司的胎牛血清配制完全培养基作为标准对照,与无血清培养基ＡＩＭＶ作对比，探讨无血清培养基代替完全培养基的可行性。 W I# z; P) q. w" }$ Y
我们从细胞增殖能力、细胞表型分析及体外CIK细胞分泌的细胞因子等几个方面进行比较。在细胞增殖能力方面，虽然ＡＩＭＶ培养基培养的CIK细胞较完全培养基培养细胞增殖迟缓，完全培养基增殖高峰期在第12天，增殖平台为第10～12天，而ＡＩＭＶ培养基增殖高峰期在第14天，增殖平台为第14～17天，但ＡＩＭＶ培养基培养的CIK细胞增殖平台期较长，增殖倍数（678.7倍）较完全培养基（638.4倍）高。这说明无血清培养基支持细胞增殖能力的更为稳定可靠，也提示使用不同的培养基在回输时间上应有所区别。在两种培养基培养单个核细胞诱导增殖的过程中，各细胞表型虽在培养过程中有一定的差异，但在增殖高峰期无明显差别。 $ W1 U: o0 i+ V9 L
CIK细胞具有较强的杀瘤活性，其作用可能与其在增殖过程中能分泌某些细胞因子有关，其主要效应细胞为CD3+CD56+细胞，并出现大量增殖，Lopez等[7]发现CD56+细胞能高表达IFNγ和TNFα，Hoyle等[8]用FACS检测到CIK细胞能表达IL2、IFNγ及TNFα，这与我们的研究结果:CIK在体外诱导培养过程中能分泌IL2、IFNγ、TNFα一致。细胞因子在抗肿瘤的网络调控机制非常复杂，IL2、IFNγ、TNFα在体内外抗肿瘤的过程起着重要的抗肿瘤及调节机体免疫功能的作用。分泌IL2，从第4天分泌量均稳定升高，都于12天达到高峰，以后逐渐下降。但AIMV培养基第12天的IL2水平（222.525±19.889）pg/ml明显高于完全培养基组（189.075±6.343）pg/ml，下降水平也慢于CM组；IFNγ水平在第4天均开始升高，第14 ～17天分泌量增大，完全培养基组第17天达到高峰为（246.854±4.758） pg/ml，而AIMV组14天达到高峰（227.88±3.048）pg/ml；而TNFα，第4～17天TNFα水平均平稳升高，完全培养基组第17天达到高峰为（247.032±9.117） pg/ml，而AIMV组14天达到高峰为（222.53±8.965）pg/ml。可见，无论是AIMV培养基还是完全培养基其分泌细胞因子的趋势是一致的，只是分泌IFNγ、TNFα水平AIMV培养基（14天）较全培养基（17天）早，但分泌水平无明显差别（P>0.05）。AIMV培养基分泌细胞因子高峰与CIK效应细胞CD3+CD56+细胞增殖高峰一致（14天），因CIK细胞回输时间最好应为在CIK细胞增殖高峰及细胞因子分泌高峰时，这有利于发挥其最佳疗效，从这方面考虑，AIMV培养基优于全培养基。 7 K6 O' @+ }! F2 q4 M0 f我们的实验表明，无血清培养基成分明确,来源稳定,功能可靠,易于质控，有利于保障患者治疗的安全。可完全替代完全培养基，避免不必要的医疗纠纷，因而在生物治疗中有巨大的优势和广阔的应用前景。 ( Y, @9 u6 ]0 S' }! s+ [ ) ^+ L% |0 g9 c【参考文献】 # M0 L% K3 p! D# R
［1］ Critzapis A D, Dimitroulopoulos D, Paraskevas E, et al. Large scale expansion of CD3+CD56+ lymphocytes capable of lying autologous tumor cells with cytokinerich supernatants\[J\]. Cancer Immunol Immunother,2002,51(8):440448.+ o0 ]6 W) v5 g, y- C2 w9 F( m
. S* r0 i; }* t8 r3 `
［2］Lefebvre P, Winter J N, Kahn L E, et al. Megakaryocyte ex vivo expansion potential of three hematopoietic sources in serum and serumfree medium \[J\]. J Hematother,1999,8（2）:199208.5 Q8 l& Z% Y: s8 I
8 |, F4 Y/ Q, J6 I0 N% Y［3］Bulter M, Burgener A, Patrick M, et al .Application of a serumfree medium for the growth of Vero cells and the production of reovirus\[J\].Biotechnol Prog,2000,16（5）:854858. # x) B" Y- d1 z; `7 H) n" h , g& Y w' |5 [# F& j［4］Kambe N, Kambe M, Chang HW, et al. An improved proved procedure for the development of human mast cells from dispersed fetal liver cells in serumfree culture medium \[J\]. J Immunol Methods, 2000,240（12）:101110. 5 j7 `3 d' `' t4 h7 l( Y/ z ; W E6 d: @2 ~6 x［5］Sekhar M, Yu JM, Soma T, et al. Murine longterm repopulating ability is compromised by ex vivo culture in serumfree medium despite preservation of committed progenitors\[J\]. J He matother, 1997,6（6）:543549.4 f2 L& p2 b5 f; {. F
/ [0 q! b% ? W5 V# J4 _9 H7 b
［6］Slunt JB, Taketomi EA, PlattsMills TA, et al. Human Tcell responses to Trichopyton tonsurans: Inhibition using the serum free medium Aim V\[J\]. Clin Exp Allergy, 1997,27（10）:11841192.% y+ L3 F; R. K' Y8 P( R) M. e
+ z. q; Y$ Y- B- c5 S
［7］Lopez R D, Waller E K, Lu P H,et al.Cd58/LFA3 and IL12 providede by activated monocytes are critical in the in vitro expansion of CD56+ T cells\[J\]. cancer Immunol Immunot,2001,49(12):629640. 2 U$ v! S2 j* }$ t- s0 g4 e% `, d& k4 ~3 ~1 ]
［8］Hoyle C, Bangs C D, Chang P, et al. Expansion of Philadelphia chromosomeNegative CD3+CD56+ cytotoxic cells from chronic myeloid leukemia patients :in virto and in vivo efficacy in severe combined immunodeficiency disease mice \[J\].Blood,1998,92(9):33183327. ' h6 L1 O* D& U; z r
! k/ k* e8 j3 f3 z; Z9 O