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请教大家一个有关阻断信号通路的问题
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作者:
ind6562
时间:
2013-3-7 19:51
标题:
请教大家一个有关阻断信号通路的问题
各位高人,我想用siRNA阻断我所培养细胞的wnt/β-catenin信号通路,有人能告诉我具体的步骤吗?
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我看的文献说是将能阻断β-catenin的siRNA先与转染液一起孵育形成转染复合物,然后将转染复合物加入到培养基中(请问大家这里是不是要用特殊的培养基,还有要不要加血清?),再用这个培养基处理细胞数个小时。请问是这样处理就行了吗,中间会不会还有其他步骤?还有一个极其重要的问题:这些过程是如何做到无菌操作的?
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如果有做过类似实验的人,能告诉我一下具体的步骤吗?感激不尽!
作者:
461650833
时间:
2013-3-8 19:28
可以构建shRNA干扰载体 直接转染啊
作者:
ind6562
时间:
2013-3-10 12:43
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461650833
的帖子
" h: H! A. c" m3 ^+ Z- `
( o; E* I0 ?# l; U- V6 s2 g
不好意思,可以讲详细些吗?
作者:
monk125
时间:
2013-3-11 09:46
这是求步骤的吗? 看你写这个是用lipo2000脂质体做的瞬转吧?
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你买lipo2000的时候会送你操作步骤的,这个你放心好了,上面很具体
: n5 b3 }& K) a& P
还有就是培养基的问题 转染所用的培养基是无血清的培养基 跟你你养该株细胞的培养基一样的 不过是无血清的 但是 实际上只是混合液是无血清的 你的细胞还是预留一部分完全培液的
. r& h5 ?4 P- F ]0 C, K* O
一般的步骤是
2 z `7 V6 K' | a8 g
1 转染前换新培液
6 t6 u7 l; ~' A
2 lipo2000与无血清培液混合静置5min 同时质粒或者siRNA与无血清培液混合静置5min
4 Z$ V0 r6 c( Z! t& Q6 X3 w
3 上述两种混合液一起混合 并静置20min
2 w( _/ l* Z9 }+ _( `+ k
4 转染细胞4-6h后换新培液
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' U% _$ v) m8 J# O) H( y' F
注意:做好control 对照试验 培液要先预热 细胞不要长太满,切提前一天铺板
作者:
ind6562
时间:
2013-3-11 17:18
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monk125
的帖子
2 i" n5 T$ h$ M# ?. T& G% C5 P! B
1 r+ H& y% N! ]9 t- M
太感谢了!!
作者:
ind6562
时间:
2013-3-12 09:59
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monk125
的帖子
* \; X N" @4 r& ]# H' y
9 k. e% x* w, Z8 {/ Y9 y
高人,不好意思,我想再请教您一个问题。好像做正式的转染实验前要做一个检测转染效率的实验(貌似是用荧光什么的来检测),但siRNA和lipo2000试剂盒里我没发现什么带荧光的东西(其实lipo2000说明书我已经看过,但里面很多内容我还不理解,惭愧~),是不是要另外买一个试剂来测转染效率呢,能麻烦您给我说明一下这是什么情况吗?
作者:
monk125
时间:
2013-3-12 16:00
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ind6562
的帖子
% Q. ]" T* A- B+ B
|. p: O' I3 F" j7 S
siRNA 就没办法做转染效率检测了,像质粒形式的shRNA是可以做效率检测的,比如你control 组的空白质粒上有GFP荧光标记,你可以做几组不同的浓度梯度,然后流式或荧光显微镜 看你的GFP positive那群细胞的比例,在某范围内应该成线性的,你就知道大致效率了。
作者:
monk125
时间:
2013-3-12 16:02
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ind6562
的帖子
+ ?0 G# N) P% b, m) Z8 o! h9 f+ `
3 P0 x p0 x2 d
siRNA 的效率怎么测 我也不懂 只能你设好梯度后 收细胞测靶基因mRNA浓度的变化了,做个realtime 就知道了
作者:
86964109
时间:
2013-5-7 09:11
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ind6562
的帖子
9 a5 z0 m. ^$ j0 A, d
4 r5 B, \0 N E! C3 L; _3 j
siRNA也可以加荧光标记的,另外,一般会设置一个荧光标记的阴性对照,侧面反映转染效率,siRNA干扰需要好多对照,详情参考这个帖子吧
http://www.dxy.cn/bbs/thread/7151795#7151795
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