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标题: 请教大家一个有关阻断信号通路的问题 [打印本页]

作者: ind6562 时间: 2013-3-7 19:51 标题: 请教大家一个有关阻断信号通路的问题

各位高人，我想用siRNA阻断我所培养细胞的wnt/β-catenin信号通路，有人能告诉我具体的步骤吗？
我看的文献说是将能阻断β-catenin的siRNA先与转染液一起孵育形成转染复合物，然后将转染复合物加入到培养基中（请问大家这里是不是要用特殊的培养基，还有要不要加血清？），再用这个培养基处理细胞数个小时。请问是这样处理就行了吗，中间会不会还有其他步骤？还有一个极其重要的问题：这些过程是如何做到无菌操作的？
如果有做过类似实验的人，能告诉我一下具体的步骤吗？感激不尽！

作者: 461650833 时间: 2013-3-8 19:28

可以构建shRNA干扰载体直接转染啊

作者: ind6562 时间: 2013-3-10 12:43

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不好意思，可以讲详细些吗？

作者: monk125 时间: 2013-3-11 09:46

这是求步骤的吗？看你写这个是用lipo2000脂质体做的瞬转吧？
你买lipo2000的时候会送你操作步骤的，这个你放心好了，上面很具体
还有就是培养基的问题转染所用的培养基是无血清的培养基跟你你养该株细胞的培养基一样的不过是无血清的但是实际上只是混合液是无血清的你的细胞还是预留一部分完全培液的 . r& h5 ?4 P- F ]0 C, K* O
一般的步骤是
1 转染前换新培液6 t6 u7 l; ~' A
2 lipo2000与无血清培液混合静置5min 同时质粒或者siRNA与无血清培液混合静置5min
3 上述两种混合液一起混合并静置20min
4 转染细胞4-6h后换新培液; E0 h0 q0 P% ~2 j- u

注意：做好control 对照试验培液要先预热细胞不要长太满，切提前一天铺板

作者: ind6562 时间: 2013-3-11 17:18

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太感谢了！！

作者: ind6562 时间: 2013-3-12 09:59

回复 monk125 的帖子* \; X N" @4 r& ]# H' y

高人，不好意思，我想再请教您一个问题。好像做正式的转染实验前要做一个检测转染效率的实验（貌似是用荧光什么的来检测），但siRNA和lipo2000试剂盒里我没发现什么带荧光的东西（其实lipo2000说明书我已经看过，但里面很多内容我还不理解，惭愧~），是不是要另外买一个试剂来测转染效率呢，能麻烦您给我说明一下这是什么情况吗？

作者: monk125 时间: 2013-3-12 16:00

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|. p: O' I3 F" j7 S
siRNA 就没办法做转染效率检测了，像质粒形式的shRNA是可以做效率检测的，比如你control 组的空白质粒上有GFP荧光标记，你可以做几组不同的浓度梯度，然后流式或荧光显微镜看你的GFP positive那群细胞的比例，在某范围内应该成线性的，你就知道大致效率了。

作者: monk125 时间: 2013-3-12 16:02

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siRNA 的效率怎么测我也不懂只能你设好梯度后收细胞测靶基因mRNA浓度的变化了，做个realtime 就知道了

作者: 86964109 时间: 2013-5-7 09:11

回复 ind6562 的帖子9 a5 z0 m. ^$ j0 A, d

siRNA也可以加荧光标记的，另外，一般会设置一个荧光标记的阴性对照，侧面反映转染效率，siRNA干扰需要好多对照，详情参考这个帖子吧http://www.dxy.cn/bbs/thread/7151795#7151795

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