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标题: 求助初养大鼠骨髓间充质干细胞，哪位高手指点一下如何测细胞周期啊？ [打印本页]

作者: shagu 时间: 2013-3-12 10:18 标题: 求助初养大鼠骨髓间充质干细胞，哪位高手指点一下如何测细胞周期啊？

本帖最后由细胞海洋于 2013-3-12 15:07 编辑 - a4 ~3 C2 t# w4 h9 L# ^) w

初养大鼠骨髓间充质干细胞，哪位高手指点一下如何测细胞周期啊？谢谢谢谢！

作者: guen 时间: 2013-3-12 10:30

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流式分析即可

作者: yinfuhua 时间: 2013-3-12 16:03

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请参考下我看到的这篇，转载给你，看能否有些帮助。/ _" t/ L) @4 S8 V6 Z

流式细胞周期检测7 T* P, B3 B$ X2 m* B/ S

流式细胞周期结果图解读(附图详解)Time：2010-12-07 PM 19:03　　Author:bioer　　Hits: 51 times 　
流式检测细胞周期操作步骤% [1 z6 w! o5 W, @
1. 细胞培养：
4 \2 ?3 G/ w  s+ `6 x
　　取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
2. 细胞固定：
　　800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。$ ^# Y! V; c4 v6 K( R" _; V- W2 A
3. 细胞染色：3 B8 `" S: l/ x+ }0 E3 j
& w! R) V/ j/ M8 Q9 B4 @
　　1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。9 B2 T1 X4 t$ y; z
- Q8 k) s. h% n* }: @
4. 流式分析：" j. z( G5 X. o8 d! N! {
　　以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！
0 P2 g( h( W; a- D9 e

流式细胞周期结果图解读　
首先来认识一下流式细胞周期结果图：

4 S2 ]0 F0 v1 {$ M( a, L0 l
　　1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；
　　2、横坐标DNA Content：即DNA含量；$ W* Y% f% C5 z; A2 T! b
　　3、G1、G2、S三期在图中已经标示；
　　4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推… 5 _0 v$ x5 G6 r9 e, d8 D  @2 _
流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：- h3 p* T& q2 k$ i* I
1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。8 \9 I# b0 j* v$ e8 j7 o/ ]" ]

　　可分为四个阶段：, {3 l  P. V2 O) i1 T( c$ ^. p. Z0 `$ g

　　　　　　
　　① G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；4 o; S' [" d* u5 _6 J
　　② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
　　③ G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；
　　④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
2、从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：
　　①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。( ?% L4 G6 h, f2 C
　　②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。
　　③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。
　　细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。: y4 E9 v3 i& H1 S( }0 U
3、流式细胞结果图各参数的意义：; y" _. u3 `, D
! x' ?% n+ d* i6 k
　　　　　( A! b& P% y/ C4 F6 n
　　常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：
　　G1期：DNA复制还没开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
　　S期：DNA开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；' h# c2 Q1 X. C
　　G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第三个峰；/ E6 O  @! ]; i( N
　　M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。

作者: shagu 时间: 2013-3-15 19:55

嘿嘿，很好很好，非常感谢！

作者: 倒腾细胞 时间: 2016-1-29 20:26

极好！感谢前辈请问现在样本已经用4%的多聚甲醛固定然后悬浮于PBS中放四度冰箱几日现在想接着做流式测周期请问是离心去PBS后加乙醇再次固定吗！？

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