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标题: 免疫荧光二抗用什么稀释？ [打印本页]
作者: 请叫我晓白    时间: 2013-3-14 12:56     标题: 免疫荧光二抗用什么稀释？

我用的二抗是TRITC羊抗小鼠IgG，说明书上说用0.01M PBS加入试剂级BSA至1%作为稀释液，意思是指：将BSA稀释到1%浓度，作为二抗的稀释液吗？
8 |( o/ M5 |8 |; Q' X5 I0 g: S我之前只用的PBS稀释二抗，效果不好，不知道是不是与这个有关
作者: yuhaoze    时间: 2013-3-14 15:16

我觉得没关系
作者: bibottll    时间: 2013-3-14 15:24

是用1%BSA稀释的，至于你染色效果不好，可能与染色许多步骤都有关系，比如透膜封闭的时间等。。。
作者: xiaoyurly    时间: 2013-3-14 16:42

回复 请叫我晓白 的帖子$ p# i9 S! s* I

9 X  `0 R/ X1 F( _  D3 W+ P我们图省事一直用PBS稀释，效果也都不错。
2 n: N# Y) \8 v9 K: w不知你说的效果不好指的是哪方面，背景高还是特异性差？
3 Z: X" c9 H( f% w  L免疫染色效果不好不能一味怪在二抗身上，很多因素，比如封闭、是否需要抗原修复、抗体浓度、作用时间等等
作者: 请叫我晓白    时间: 2013-3-14 17:11

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/ O8 u* X! b7 \/ \9 X& d0 B' Z
/ S, l$ T9 d% G6 o% o  I0 \(l)连续冰冻切片标本，丙酮固定10min，用PBS3min 3次。1 H* s7 R; D6 l0 ^) m2 H
(2)3%过氧化氢孵育10分钟，PBs冲洗三次。
/ @7 w- Z1 B' @3 l(3)正常羊血清封闭液室温孵育20分钟，倾去，勿洗。2 r2 ?# @7 ~4 `/ K2 a2 q7 F
(4)加入50ul一抗（1:100,1:200）。37度 2h$ l* Z6 F& p3 R1 q0 T/ i* S9 P
(5)滴加50ul二抗 室温 30min，DAPI复染5min4 P, E; g: _, g+ A& Z& ~
(6)封片:封片剂封片- g3 ^' e( G; h6 W
这是我的大概步骤请指导一下哈。非特异性染色比较多
作者: xiaoyurly    时间: 2013-3-14 17:22

回复 请叫我晓白 的帖子
& X7 h. i1 n/ q/ W5 @: }
; u6 O0 g  Y$ j1 n0 @荧光染色不用H2O2处理+ X5 J: r3 s* U/ |8 D
一抗是什么？胞内抗原染色需要Triton破膜处理的
5 R& ^5 E) |( m5 W' N7 f抗体作用终浓度在2-5ug/ml即可，酌情稀释抗体
& p- T# M( b, _" @
3 a2 @) X, K% h+ s' i0 q私认为一抗4℃过夜效果较好，血清封闭在30-35min
作者: weiyepan    时间: 2013-3-14 20:42

一抗二抗都加点BSA或者脱脂奶，防止非特异性吸附，在ECL中降低背景效果比较明显。荧光抗体强度应该不会比ECL高，加了效果不一定明显，但也可以试试。
4 M9 J3 T. A* b, A# V; v9 C: u: W另外你一抗我看是不是浓度太高了。
作者: 芦苇浅    时间: 2013-3-15 09:47

我们做石蜡切片的免疫荧光一般用1%的BSA稀释抗体，1%的BSA指的用0.01M的PBS将BSA稀释至该浓度。
作者: 请叫我晓白    时间: 2013-3-17 16:04

回复 xiaoyurly 的帖子5 ]: n) M  K3 K0 |. D

" w, H& D  N" D* g多谢这位老师指点。H2O2处理消除内源性过氧化物酶是一篇研究生论文上做心脏组织免疫荧光用的方法，我学习他的方法做的。
) [6 J5 C) P' H+ I8 {5 C一抗是大鼠抗大鼠c-kit，说明书没有建议稀释比例，因此我用了1:100 1:200 两个浓度。一抗产品的浓度是0.5mg/ml 规格100ug。这点还请您指点关于一抗的比例问题。0 y$ w: E( }' G/ x8 n: q' ^
抗原是位于膜上因此没有破膜
4 C" ]/ C! }" k3 ^血清封闭37度半小时是否要比室温效果好呢
作者: 请叫我晓白    时间: 2013-3-17 16:27

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% ?& h7 D' e, u9 e% N; q1 ^& Z( l6 q3 q( C$ D6 Q
我的一抗规格是100ug/200ul（浓度是0.5mg/ml），也就是1ul含0.5ug，按您说的2-5ug/ml，我刚去算了一下1：100稀释正好是5ug/ml，1：250稀释是2ug/ml，也就是说的一抗可以试一下1:100-250之间浓度梯度对吗？
作者: 请叫我晓白    时间: 2013-3-17 16:29

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5 n5 Y1 M3 o. X9 f" }8 M  n/ S! ]( a
一抗规格是100ug/200ul的请问一般用什么浓度呢
作者: xiaoyurly    时间: 2013-3-18 09:44

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7 X% v( Y3 W- U9 ]; u1 X
2 V  k! r$ v# S. _是这个意思，再尝试一下吧，免疫染色有时候确实难出，加油
作者: xiaoyurly    时间: 2013-3-18 09:50

回复 请叫我晓白 的帖子! F# b6 y- g1 @

* f4 }% A# O2 \# _/ V" Kc-kit染色确实不必破膜的，我们以前也做过大鼠冰冻切片但是效果不尽如人意，后来用了石蜡切片经过抗原修复才出的结果，而且我们是用santa的抗体都能出（1:100），荧光染色我们从不用H2O2处理，可以上一张图片给你看下，心肌切片

图片附件: 无标题.jpg (2013-3-18 09:50, 13.44 KB) / 下载次数 666
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NTAyMzZ8ODFiNzQyNDJ8MTc5NDE5OTI5N3ww

作者: ruth891005@yaho    时间: 2013-3-18 10:45

PBS或者BSA都可以，可以都试一下，比较一下效果
作者: 请叫我晓白    时间: 2013-3-18 12:15

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$ P) r* R9 p( R/ C7 j
3 L" h# B) v8 j% Q+ G多谢老师耐心解答8 B4 a  o' b! P4 \2 b# @8 O
能copy一份您做石蜡切片免疫荧光的步骤给我吗- Y( [9 D: |; s* Y" M, k! z7 N- z7 w
刚接触实验很多都不懂
( P: q6 }: y3 U5 h7 |3 Q多谢了
作者: xiaoyurly    时间: 2013-3-18 12:53

回复 请叫我晓白 的帖子# B1 S! J6 i8 r2 I( T2 o
3 ~, P8 s9 l; R4 F& u9 y0 t6 K- N' ?
石蜡切片常规脱蜡复水，柠檬酸缓冲液热修复，88-96℃ 15-20min，冷却1h后PBS洗一次，羊血清（原液以1:20比例用PBS稀释）封闭室温30min，一抗1:100溶于含羊血清1%的PBS中，4℃过夜；转天取出复温1h左右，PBS洗5min×4次，对应荧光二抗孵育，4℃ 4h or室温1h，PBS洗4次，封片镜检
作者: 请叫我晓白    时间: 2013-3-18 14:01

回复 xiaoyurly 的帖子+ r5 K  {% O- J! B

* Z* v1 a' t+ f+ u7 ~8 O: N多谢多谢
作者: nevermore    时间: 2013-3-21 13:58

用BAS稀释抗体和用PBS稀释 原理上有什么不同？我试过用PBS稀释，信号强度很弱。另外，抗体浓度过高会使结果强度降低么？为了提高荧光强度，我特意提高了点工作浓度，可效果还是不好，其他步骤都是按照标准protocol
作者: 细胞海洋    时间: 2013-3-22 14:50

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, V+ v/ X8 s% L" K5 A( s  N& s* j  w$ K. m. ?% E& P
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作者: 请叫我晓白    时间: 2013-4-13 13:17

xiaoyurly 发表于 2013-3-18 09:50 / v3 t( L: B+ D$ O+ e4 V+ \0 P: g. d
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) R5 I! b6 {  ~. v8 T& g6 e
& E: L. ]# V5 w/ ic-kit染色确实不必破膜的，我们以前也做过大鼠冰冻切片但是效果不尽如人意，后来用 ...
9 [# h4 O/ T: g
老师，我最近做了几次都没有结果您图片上的结果。哎 郁闷。我想请问您当初做冰冻也没做出来会不会是因为c-kit这个抗原不适合做冰冻切片？需要做石蜡切片才行？我想可能有几个原因：1.c-kit+细胞很少没有切到或找到2.一二抗浓度不合适3c-kit这个抗原不适合做冰冻切片
+ M/ Y9 H  ~5 s3 e8 y6 j8 W就您的了解c-kit是否可以做冰冻切片呢？我看了许多国外文献他们的染c-kit的方法都是免疫组化用石蜡切片（具体方法太简略了），但是结果的图却是共聚焦的图。期待您的解答。还有您做的是骨髓的c-kit细胞吗？我做心脏固有的c-kit细胞
作者: 细胞海洋    时间: 2013-4-14 21:06

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' b! V1 |+ m% r/ `5 q1 B# \, f8 h) T4 K0 ?7 b( s; C9 i
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作者: xiaoyurly    时间: 2013-4-17 15:45

回复 请叫我晓白 的帖子
; A# C6 {' B8 C7 ]$ n+ O" l2 J5 i8 H9 w0 i
染冰冻的确实少，但是抗体说明书上明确表示可以用于冰冻切片染色，我们染不出来才换成石蜡，成功率才高了的。  R  r$ _$ d6 S$ K9 J
我们做的是心脏切片染色，心梗后5天的组织切片，还在炎症反应期间，所以c-kit阳性细胞较多，常规荧光显微镜拍摄。现在用共聚焦的挺多，照片清晰度更高。如果是正常心脏固有的c-kit阳性细胞应该是比较少，你是想染心肌干细胞吗？可能需要大量切片染色，然后耐心找视野
: T( |5 c/ [' w2 D/ `* T" q
作者: 请叫我晓白    时间: 2013-4-17 20:41

xiaoyurly 发表于 2013-4-17 15:45 + ]( \; t3 R$ A
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- y& h# t3 ]- m" _8 n: E
  G' L7 x( I5 n8 ^' y  u染冰冻的确实少，但是抗体说明书上明确表示可以用于冰冻切片染色，我们染不出来才 ...
4 |1 N( ~) f) U+ j3 s0 o
是的，是染梗死后固有的c-kit心肌干细胞，没有注射细胞，所以找不出来，根本达不到文献上那种效果。
" a/ U3 U( o" D$ i- `9 r真是郁闷。准备再做几次试试。有新问题的话还请您多多指教啊
作者: xiaoyurly    时间: 2013-4-23 16:55

回复 请叫我晓白 的帖子* D5 p/ c6 T, j/ v" d9 g
# O: t5 |; h* H
没问题，祝好运
作者: 请叫我晓白    时间: 2013-5-14 17:57

回复 xiaoyurly 的帖子& Q) A8 q" C/ ]0 h3 E% |
/ s) {! S, E- Y* d; m8 Z" Q

; h  u! I  d. V; r' r
7 z+ i" a7 q* D, i0 X% M5 b# `
/ r& h* k8 v4 Z' `" V, e. W老师，我又做了一次，请你帮我看看这张图是细胞吗
作者: 细胞海洋    时间: 2013-5-15 12:07

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1 I, g5 a$ G- s" V/ y( S
) M" z% L* @! E+ j请直接上传论坛
作者: jiaozi    时间: 2013-5-15 23:00

我以前用的是PBS稀释的，不过效果也挺好，是否BSA关系不大
作者: yangcy-smile    时间: 2013-5-17 10:25

我们一般是用5%的血清进行封闭以及一抗和二抗的稀释，效果都挺好的。然后关于一抗稀释比例我们细胞的话用的最高的是1：400，二抗一般是1：1000.组织的话可能要酌情提高比例，但是我觉得要是染表面标记的话，二抗比例不宜很高。个人观点，不对之处，请各位指正。
作者: xiaoyurly    时间: 2013-5-24 12:10

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  t7 ?! _0 Y& `3 {
1 `$ K, ?6 b" H  `  p我看不到图片
* M! n! B; n: C& X4 t! G2 T3 R
作者: 请叫我晓白    时间: 2013-5-24 14:58

回复 xiaoyurly 的帖子* I( U- x; j9 c. r2 J7 v

) H+ p3 }/ J# E' F" A) D kit-g合成-400.jpg

图片附件: kit-g合成-400.jpg (2013-5-24 14:58, 148.49 KB) / 下载次数 631
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NTIxMTN8MTExYTZhZjR8MTc5NDE5OTI5N3ww

作者: xiaoyurly    时间: 2013-5-24 16:59

回复 请叫我晓白 的帖子: u. W$ l! C: s7 i

0 W! y# `5 t" [# k& M这次看到了，不错，看着挺像阳性染色的，应该是了
作者: 请叫我晓白    时间: 2013-5-24 17:01

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; ]) v, F3 {% R7 [8 Y' ?/ x% v6 Q6 ]
多谢肯定。只是这个心肌的核怎么那么密啊感觉好几个核挨在一起。您染的心肌也是这种情况吗？这是400倍镜下，切片是6um的。谢谢
作者: xiaoyurly    时间: 2013-5-24 17:23

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4 r- S4 \, V4 Y. p
7 J+ r2 \7 t3 H- f6 b细胞核没有问题，心肌细胞的细胞核确实挺密的
作者: 请叫我晓白    时间: 2013-5-27 10:11

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1 W' b, F" b: ]# G8 @2 E! J, m
/ E1 v1 G2 J7 ]6 T多谢老师解答



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