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标题: 电转试剂盒LONZA以及电转细胞与质粒比 [打印本页]

作者: hjd8886 时间: 2013-3-18 11:16 标题: 电转试剂盒LONZA以及电转细胞与质粒比

求问LONZA电转试剂盒全名，用于电转角质细胞的用哪一个？电转仪参数？! ^+ M7 x8 z/ i x' c
另外电转的时候细胞和质粒的比例大概多少合适？看之前论坛里发的“细胞和质粒的比例我用过30ug-80ug：106-107”这个是100万的细胞用30ug的质粒吗？

作者: genedu 时间: 2013-3-18 16:37

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前几个问题，您去他的网站上查查，都有。
“100万的细胞用30ug的质粒”个人感觉太多了，细胞受不了，会死很多。按照我的经验，100万细胞用3-4微克质粒即可，当然质粒的浓度最好在1ug/ml左右，仅仅是个人经验，仅供参考

作者: genedu 时间: 2013-3-18 16:40

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再啰嗦一句，如果是要电转细胞，并且电转的细胞还要进行后期操作的话，最好是用区内毒素的试剂盒进行大提质粒

作者: hjd8886 时间: 2013-3-19 09:06

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灰常感谢啊，不过昨天已经电转了，呵呵。! w' t6 I5 h+ C4 T5 F
我的是一个10cm盘的角质细胞，然后分了4次电转，一次大约150万的细胞对应6ug的质粒，第一次电转的时候，电转仪报错，转盘很快的就转回来了，不知道有没有电转成功，怕再次电转细胞会死很多，就没有处理，然后就直接转移到10cm盘培养，但是没有及时摇匀，好多细胞都贴壁了，汗。。。。

作者: genedu 时间: 2013-3-19 17:10

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我用Lonza大概电转了将近1000次了，针对您的问题给你点儿小建议：1 100万的细胞用4ug质粒，点击液100ul的体系最佳，点击液注意4℃保存。2 电转仪报错，转盘很快的就转回来，就是电转没有成功，必须重新电击，不然的话是不起作用的。这里面有几个原因：一个是细胞量太大造成的；一个是质粒量太大造成的；一个是电转程序不对造成的，一个是电击杯中有气泡造成的。3 针对您“直接转移到10cm盘培养，但是没有及时摇匀，好多细胞都贴壁了”的问题，在电转完成后，应该先将电击的细胞马上转入培养基中（培养基根据所要铺板的多少，应提前准备在15或者是50ml离心管中），再用移液器混匀，铺板，问题就解决了

作者: hjd8886 时间: 2013-3-19 20:07

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非常感谢啊，今天看了下细胞，第一组报错的确实是没有电转成功，好多细胞都贴壁的，而另一组电转成功的细胞死亡非常多，贴壁的倒是很少，两组之间细胞密度差距非常大。

作者: genedu 时间: 2014-2-22 17:27

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不好意思刘同学，我的QQ是经常不上的，有什么问题您直接在这里讲就中，本人保证知无不言言无不尽，相互交流共同提高

作者: sirius_zou 时间: 2014-2-25 15:13

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您好，我也正在做核转染诱导ips实验; s: a/ E" z. @. K s" P1 P. y- c
请问您做过悬浮细胞的电转吗？电转后细胞死亡多吗？我电转100万个CD34细胞用10ug质粒，2天后细胞死亡一半以上，正常吗？

作者: genedu 时间: 2014-2-25 19:03

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电转悬浮的细胞和贴壁的成纤维细胞之间并无太大差别，不过每种细胞因为他们的直径大小，细胞膜厚度以及承受电容的不同，需要进行一定的程序摸索（LONZA网站上提供的只是参考电转参数），一般的来说，电转后死亡10-30%，属于正常死亡。电转100万个细胞用100ul的电击液和4ug的质粒就足够了，多了反而会造成细胞的死亡，质粒最好是大提的（去内毒素）。我之前电转过鸡的悬浮淋巴细胞，电转参数为B013，效率还是蛮高的，仅供参考。如果是第二天加药物筛选的话，2天后死亡一半还是比较正常的，当然这也和你的电转质粒的整合率和表达情况是相关的。所以，假如您应该先摸电转程序和适合的电击液，后电转pMAX-GFP（自带）质粒，统计电转效率，再做定夺。

作者: Jonathan 时间: 2014-3-13 14:27

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我用了6ug。1m的CD34+cell。完全没问题。细胞会死一些。ips出的杠杠的

作者: wmeng 时间: 2014-3-17 14:40

回复 genedu 的帖子; n7 S6 S* P7 f: {# ~
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你好，请问你用的是Amaxa NucleofectorⅡ电转仪吗，我现在在做将pEGFP-N1转染Jurkat细胞（一种悬浮细胞）的实验，电转条件是这样的：我用的是250微升的体系，其中210微升细胞（约1000万个细胞），40微升质粒（40微克），电击液直接用的是培养液RPMI1640，电转杯是BTX公司的2mm电转杯，电转之后效率很低，大概不到10%的转染率，细胞计数结果细胞大约死了80%，其实我原来也试过100微升的体系（我看了你之前的帖子里说最好是100微升的电击液），细胞100万，质粒2微克，电击液是一个师兄给的他们自己弄得另一个细胞的配方，结果几乎没什么荧光，细胞也基本都死了。我想问一下，你们有没有做jurkat电转实验，有没有什么经验可以指导一下，或者能给我一些建议吗，另外你们的电击液是买的吗，还是自己摸索的？谢谢

作者: genedu 时间: 2014-3-17 15:38

我用过Amaxa NucleofectorⅡ型的，你的250微升-210微升细胞（约1000万个细胞）-40微升质粒（40微克）体系，确实有点儿过，这个体系最好是200ul点击液，200万-400万细胞量，8-10ug质粒。电击液直接用培养液，电转效率肯定大打折扣。但如你若说细胞出现大量死亡的现象唯一可以解释的就是你的电转程序不对，在Amaxa NucleofectorⅡ中是没有一个固定的电转程序的，对于不同的细胞需要在几个候选的程序中就行pMAX-GFP质粒的摸索，最后才能确定最佳的电转程序。电击液是LONZA公司赚钱的主要来源，我等P民是不会摸索出来的，如果你有效价比能媲美原装电击液的东西的话，那只能说，你去开公司吧，定能赚的盆满钵满。另外我之前做过一个鸡的淋巴悬浮细胞的电转实验，电转程序用的是B013，电转效率最起码在一半以上，仅供参考

作者: 细胞海洋 时间: 2014-3-17 18:30

本帖最后由细胞海洋于 2014-3-17 18:30 编辑 ( [1 m9 d+ J2 b6 ~! _

回复 wmeng 的帖子
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看12楼

作者: wmeng 时间: 2014-3-17 18:56

回复 genedu 的帖子

但我用的那个程序就叫是专门为Jurkat设计的，叫Jurkat-001（高存活率）和Jurkat-005（高表达率）。我猜转染效率低是不是因为电压太高的原因，确实正在考虑换一个程序试试，就先试一下你推荐的B013吧，谢了:)

作者: 刘金莹 时间: 2014-5-29 11:00

回复 genedu 的帖子# u6 Z/ p# W1 m, p/ S% p: X

请问您做过神经干细胞的电转吗？ lipo2000的效率在1%左右

作者: genedu 时间: 2014-5-29 13:52

回复刘金莹的帖子! |9 E% Z7 | r) Z( n- ~
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真是对不起，真没电转过神经干，不过电转程序可以参考lonza网站

作者: canyon 时间: 2014-6-13 11:34

Jonathan 发表于 2014-3-13 14:27 5 }$ ^. B5 S# \! H& u
回复 sirius_zou 的帖子
- r5 J6 ^, V4 F. U7 Q4 g8 j: s, |
- I: M7 X1 L$ a% D. @0 @% |* j我用了6ug。1m的CD34+cell。完全没问题。细胞会死一些。ips出的杠杠的

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Jonathan, 你的CD34+细胞的分离一般需要多少ml血液？

作者: 缥飘实验员 时间: 2015-10-12 20:41

回复 genedu 的帖子1 y% U3 G1 f, p8 F. V: |
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前辈好，请问有没有做过 H1和 H9 的电转，现在使用 lonza NucleofectorTM 2b device 仪器，0.22的杯子，细胞100万个，100ul体系。使用 A-023程序，现在做了GFP 2ug、7ug 的电转实验，连 GFP 都没有转进去，零星的看见几个细胞。% D. K' Y+ {5 e5 z. [( R
1、转后接种到一孔六孔板上，细胞贴壁率很低不足20%，或者更严格的说只有10%，这个主要原因是细胞状态吗，还是操作有问题？对于这样需要融合度为多少合适，60%？80%，大概需要生长几天？还是电转前一天高密度接种第二天消化电转。消化我发现使用 TrypLE酶不容易吹打为单细胞，是不是 accutase 更好些？ x5 P# m/ B! _4 W! b
2、电转液为一般的盐溶液，是这边的实验室的 protocol，具体配置不知道，转别的细胞是没有问题的。使用 bio-rad 的仪器用 PBS 作为电转液，效率也挺好的。这个是不是需要自己摸索，有钱直接买kit 是不是更好？
3、现在处于预实验，摸索条件做细胞梯度好还是质粒梯度更好？) L1 I' s% m, n) h
4、电转实验细节上有没有特别好的建议希望分享一下，! z5 E/ ]# N& E; c) T

说的有点乱，还请不介意，期待您的回复

作者: royltc 时间: 2015-12-5 09:57

回复 genedu 的帖子1 n6 l7 }7 L+ T( @7 J, @+ }
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你好，我用solution T转染的cho-k1 ，转染之后培养基中就有黑黑的点状或者片状的东西，细胞死亡也差不多一半的样子，请问那些黑黑的东西是什么啊？

作者: genedu 时间: 2015-12-5 15:21

回复 royltc 的帖子

是一些细胞碎片之类的东西，有可能你还得多摸索几个转染程序

作者: wzm123hzy 时间: 2017-9-18 17:25

前辈您好，我最近想用Lonzad 4D X-unit 电转仪转染脂肪干细胞。之前没有用过电转仪，想向您我请教一下：您们用的电转缓冲液是专门从Lonza 官网上购买的吗？还是直接用opti-MEM呢？打扰您了，谢谢。

作者: 云下的风筝 时间: 2018-4-7 23:56

回复 genedu 的帖子# i5 A1 u0 J) n0 [
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您好，genedu，请问您是否有用过Lonza的试剂盒电转过T细胞，这块经验空白，买了个试剂盒，电转了好几次，活细胞就10%:L

作者: oooet 时间: 2018-12-19 10:03

回复云下的风筝的帖子! S( Q# }0 Q; ?% H6 x" o

加我qq吧 1270050018，不知道我的电转程序是不是能用于你的实验

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