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标题: 求助人羊膜间充干细胞分离方法！！！！我的细胞不生长求助！！ [打印本页]

作者: congxiaoran 时间: 2013-3-28 19:54 标题: 求助人羊膜间充干细胞分离方法！！！！我的细胞不生长求助！！

我采用的是先30min胰蛋白酶消化上皮细胞，再用0.75mg/ml 的I型胶原酶消化间充质干细胞30min，所得的细胞3d换液后不生长，求原因？希望各位大侠提供更好的方法，不吝赐教！！！

作者: coffee.cat105 时间: 2013-3-29 09:49

不用消化上皮，第二天换液，把不贴壁的洗洗倒了就好了，间充质的生长速度，上皮是拍马都赶不上的，你要实在不放心，P1的做个单克隆也可以，你这个方法白白伤了细胞，其实意义不大

作者: congxiaoran 时间: 2013-4-1 12:39

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: [5 n' t& r9 O, i- Z* I0 y* i3 n+ T
您的意思是直接用胶原酶消化吗？能说的详细点吗？谢谢

作者: coffee.cat105 时间: 2013-4-3 10:45

没有什么需要详细的了啊，就是剪碎，胶原酶消化，具体消化时间要看你的酶，你的组织，30MIN其实差不多了，消化完2500G离心，离心完加上培养基养，第二天把上清倒掉，换液，基本上就可以看到贴壁的细胞了，增殖很快的，传个一两代就很纯了，如果不放心，做个有限稀释，间充质没什么细胞密度要求，一个也能很好的长起来。

作者: congxiaoran 时间: 2013-4-3 15:38

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好的谢谢

作者: ruofan1982 时间: 2013-4-8 11:36

1.整块羊膜先0.05%胰酶消化30分钟，然后中和，PBS洗3-4次，尽可能去除上皮细胞。- M4 @# B2 c* o- W
2.剩余的羊膜用1mg/ml胶原酶I消化1小时，洗涤离心，收集细胞。此时得到的细胞多数为间充质细胞。
3.羊膜上皮细胞生长速度很慢，且状态不好。传代一两次就可以纯化间充质细胞了。

作者: 硕果累累_555 时间: 2013-4-8 12:49

回复 congxiaoran 的帖子9 I0 K: L- |1 O! r% D

先用胰酶再用二型胶原酶消化，消化的一定要彻底些，否则细胞不容易爬出来。通常第二天细胞就能游离出来，3-5天即可传代。

作者: congxiaoran 时间: 2013-4-8 15:41

回复 ruofan1982 的帖子0 I, N8 D4 C d7 z
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非常感谢！！！！

作者: congxiaoran 时间: 2013-4-8 15:42

回复硕果累累_555 的帖子
m/ C* g; d: M
请教下您的意思是用胶原酶消化过夜吗？

作者: 硕果累累_555 时间: 2013-4-9 14:24

回复 congxiaoran 的帖子8 f) y$ q8 e4 d5 D
4 l* L, L/ W9 {4 j+ Z) R+ E. E5 }
不是如果直接用胶原酶消化可以过夜试试，如果先用胰酶再用胶原酶，可以将胶原酶消化时间适当延长，具体延长时间要你观察组织消化的程度决定。

作者: congxiaoran 时间: 2013-4-10 09:56

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好的多谢！

作者: 柏林小杨 时间: 2013-6-4 10:51

选对培养基，上皮细胞可以忽略掉，所以可以省去胰酶消化的步骤。

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