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标题: 怎么检测是否有支原体污染 [打印本页]

作者: 怡雯小叶叶 时间: 2013-4-15 22:26 标题: 怎么检测是否有支原体污染

如题，怎么样检测支原体污染，听说用DAPI染核，请问怎么染？

作者: jiguojie87 时间: 2013-4-16 08:14

1 培养基( j# R* X/ t+ q' u( v; S
检验禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗，用改良Frey氏培养基。+ {* e" x6 k/ `' R  U& G2 g9 b
检验其他种类细胞和病毒活疫苗，用支原体培养基# M2 Z% V9 Y8 b8 H3 w: F4 o' l9 a2 P
检验血清用无血清的培养基
2 检查法
样品处理每批制品取样5瓶，液体需混合；冻干制品需添加液体培养基复原成混悬液后混合。检测血清时用血清直接接种。0 P# D* ~! P5 p8 U
疫苗的检测接种于观察每个样品需同时用以下两种方法检测
液体培养基培养将疫苗混合物5.0ml接种小瓶液体培养基中，再从小瓶中去0.2ml移植接种于1小管液体培养基中，将小瓶与小管置于37℃培养，分别于接种后5日、10日、15日从培养瓶中取出0.2ml培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红，如果无变化，则在最后一次移植小管培养、观察后14日后停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任一小管内液体颜色出现明显变化，在原pH变化达0.5时，应立即移植于液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。6 H6 b* k: S$ E* [0 h6 |6 y( H
琼脂固体平板培养在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1-0.2ml接种于琼脂平板，置含5%-10%二氧化碳。潮湿的环境、37℃下培养。此外，在液体培养基颜色出现变化，在原pH变化达到0.5时，也同时接种琼脂平板。每5-7日，在低倍显微镜下观察各琼脂平板上有无支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落时，停止观察。* O3 ~  U& C: {* Q9 n" F
对照  每次检查需同时设置阳性、阴性对照，在同条件下培养观察。检测禽类疫苗时用滑液支原体作为对照，检测其他疫苗时用猪鼻支原体作为对照。) `( b6 u9 N% k) d5 V
血清的检测取本血清50ml代替培养基中的马、猪血清，按附录38页培养基配方配成大瓶培养，按2.2.1.2项稀释、移植、培养，观察小管培养基的pH变化情况和琼脂平板上有无菌落。
3 结果判定
接种本物的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落时，判定血清或者疫苗不合格。$ @* o) x/ Q4 i) h/ Y$ Y$ T8 t
阳性对照中至少有一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。9 o2 N+ M, M% l# s2 N5 D: _

作者: lumenghua 时间: 2013-4-16 10:38

现在市场上有支原体检测试剂盒，采用的是PCR原理，一天时间就可以检测出来了，比较快捷

作者: 怡雯小叶叶 时间: 2013-4-16 11:29

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8 Y! q$ M" L( D; Q4 o: s* S
有用DAPI染的么？

作者: 452359357 时间: 2013-4-16 15:00

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DAPI介绍 % l/ v/ f) Z! d% m) i  _
在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在400nm左右。 DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)或Texas Red染剂(红色荧光染剂)的发散波长，仅有少部分重叠，研究员可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。 DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。 DAPI 分子式：C16H15N5 分子量：277.324 CAS number：28718-90-3 光谱性质：与双链DNA结合时最大吸收/最大发射为358 nm/461 nm；与RNA结合时，最大发射移动到400 nm左右。  编辑本段DAPIDAPIDAPIDAPI染色原理染色原理染色原理染色原理
染色原理：DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。 a、正常的烟草细胞核：核形完整，染色质均匀。 b、染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。 c、染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质。 d、细胞核破裂形成碎片，核解体。
染色步骤
在细胞移植前，将DAPI 以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS 缓冲液漂洗至少6 次以洗掉未结合的DAPI，在用酶消化后离心收集细胞，加入DMEM 培养基制成细胞悬液以备用。 + t# H: M3 G- y0 }9 {1 x
存储条件：-20℃避光保存每次使用，用量较少，可反复冻融，无需分装注意事项： 1、DAPI强烈致癌，操作时要戴上手套。 2、贮存液用70%酒精配制，浓度100 µg/ml，可用黑纸包住，长期冻存。使用液按1:1000用PBS稀释，最终浓度100 ng/ml。 3、DAPI是非常优秀的DNA染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。

作者: 怡雯小叶叶 时间: 2013-4-16 18:17

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亲，我想问怎么用DAPI检验支原体污染，不要用DAPI染细胞

作者: 褚cell 时间: 2013-4-17 14:27

回复怡雯小叶叶的帖子# C- T$ ?; d0 t x
& P* i# V8 f- @& t. o
一般说，在支原体污染严重时，不仅细胞核区有蓝色荧光，细胞质中也有模糊蓝色荧光，是支原体造成的，不过在污染早期，不大适用，具体可行否，还要做对比试验。

作者: 褚cell 时间: 2013-4-17 14:29

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补充一句，蓝色荧光来自DAPI染核后观察~

作者: 怡雯小叶叶 时间: 2013-4-17 16:44

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2 _" t' D% I' b& P
thank you

作者: 184lj 时间: 2013-4-17 23:26

染色法检测支原体污染，一般先做细胞爬片，固定后DAPI染色；荧光显微镜下观察，干净的细胞只有细胞核染色，污染支原体的细胞会出现点状、絮状物。

作者: hai344239012 时间: 2013-7-13 17:47

直接PCR 就可以了

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