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标题: 脐带血间充质干细胞提取 [打印本页]

作者: 小公 时间: 2013-4-17 14:49 标题: 脐带血间充质干细胞提取

昨天用淋巴细胞分离液法分离脐带血，分离液是GE FICOLL，密度1.077， 1 首先脐带血与PBS 1比1 混合均匀， 2, 缓慢叠加与分离液面上，比例1:1, 3 , 2000r/min，离心30min ，始终未发现白膜层，不知哪里出问题？看上去只有2层，上面是黄色血清，下面是红细胞。

作者: bsx1111 时间: 2013-4-17 20:13

离心时应该快升慢降速，降速太快层容易分散，再有你的脐血中细胞是不是少啊，不用PBS稀释，直接加与分离液面上，比例1:1试一试

作者: 小公 时间: 2013-4-17 22:01

回复 bsx1111 的帖子- D4 [3 r# f7 y ~8 t5 k0 A8 u

离心机的设置确实是个问题，脐血量不少，大约80ml，不和pbs混合的话，是不是太弄了，不容易分层啊？谢谢

作者: 壹DD 时间: 2013-4-18 12:03

1.采集的血量足够？血用盐水稀释？2 Y8 [: U" b) n- Y0 O, Q
2.稀释后的与分离液的比例为2：1; B. G3 v4 _: q- m: Z- B+ R$ F
3.用50ml的锥底离心管
4.离心机是否达到要求？品牌，thermo,设置参数：升降速、离心力、时间？

作者: HHvivian 时间: 2013-4-18 12:27

脐血一拿到应该尽快处理，不知道你的保存时间是多少？时间越久，分离效果越差，甚至分不出白膜层。

作者: HHvivian 时间: 2013-4-18 12:29

应该有四层的，从上往下，黄色血浆层，白色白膜层，透明的分离液，红色红细胞层。

作者: pailishi 时间: 2013-4-18 12:58

离心加减速度调为0，也就是带刹车即可，3ml脐血也可以分出白膜层

作者: 小公 时间: 2013-4-18 15:47

回复壹DD 的帖子
9 h# c# A: e+ ~! \; A
你好，血量是足够的，80ml，用PBS稀释的，离心机是水平转子的，2000转，30min，估计是升降速度的问题

作者: 小公 时间: 2013-4-18 16:39

回复 HHvivian 的帖子5 j4 s" K+ s, n* o$ J* `# A Q9 |
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你好，脐血收集后4小时分离的，下次早点提取，另外，血量80ml，需要用淋巴细胞分离液很多，可以先进行脐血离心去除血浆或者进行羟乙基淀粉沉淀吗。谢谢，另外，分离液你用的是哪一种？

作者: 呼吸 时间: 2013-4-19 08:48

1、脐带血不要保存时间太长
2、用分离液时，最好使其在常温/ ?+ n; H- X; ^4 Z
3、稀释后的与分离液的比例为2：1. X) ~- E! d, r" a
4、可以尝试一下1310g、20min8 ^" i$ o( D* v' Q1 l7 b+ Y
5、降速一定要慢5 t5 x- [! G- o* e1 P0 n, k' X5 s- h
6、脐带血培养间充质细胞，是有一定几率的
7、祝你好运，下次一定成功。

作者: 小公 时间: 2013-4-19 09:16

回复呼吸的帖子
1 f" ]7 N" _7 c! z$ G! |
谢谢，下次逐渐改进试试吧，

作者: 250286645 时间: 2013-4-19 09:59

为什么不用脐带间充质干细胞呢，脐血中大部分都是造血干细胞，间充质的量很少

作者: 小公 时间: 2013-4-19 18:09

回复 250286645 的帖子) H2 E; m; e- n2 E. J

嗯，老板的课题是脐血，没有办法的啊

作者: HHvivian 时间: 2013-4-23 16:40

回复小公的帖子
6 W1 D( Z( R- z) {7 O. o6 M
我试过甲基纤维素进行沉淀的，单个核细胞损失率大。我用的是1.077的FICOLL分离液。我觉得也要从温度上考虑分离效果，最好分离前要先将分离液预热37度，脐带血从冰箱拿出来之后，不要立刻处理，温度太低会影响分离效果。

作者: 小公 时间: 2013-6-19 08:39

回复 HHvivian 的帖子7 D: A: o: G2 r7 a
2 E$ Z2 _. D0 \- c# |4 |' M. q: [
谢谢，你好，我之前先用羟乙基淀粉沉淀，再用ficoll分离，效果不好，杂细胞很多，请问你是直接用ficoll分离的吗？

作者: HHvivian 时间: 2013-6-19 12:02

回复小公的帖子9 t; s$ z/ t+ ?5 T/ T* T
5 f( h& F G6 e
对，杂细胞很多，而且目标细胞很少，不容易养活，我直接用FICOLL试过2次，完全没养活，有贴壁的细胞，可是养了1-2星期，没怎么增值。

作者: 小公 时间: 2013-6-20 08:04

回复 HHvivian 的帖子( {; C9 ]% I9 j3 e; J

是的，即使增殖的也是杂细胞，圆形大的破骨细胞，养了2个月了，没有成功，郁闷啊，你现在还养吗，

作者: HHvivian 时间: 2013-6-21 15:02

回复小公的帖子0 z7 [8 H3 Y+ \6 E, E1 h
9 t+ g0 ]* W# k* A' @7 c2 o
我现在不养了，直接养脐带间充质干细胞。2 u" ^) q) D b( o* ^! ?

作者: cold儿 时间: 2013-7-8 22:53

离不出白膜和离心机有很大关系

作者: songhang2013 时间: 2013-7-31 13:39

是不是离心时间长使得单个核细胞又离到红细胞层里去了

作者: Life_Tech 时间: 2013-8-1 09:44

分离液我用过好几种，Axis-shield公司，Sigma的Histopaque®-1077，还有一种国产的，GE的没有用过。三种都是分得出来的，国产的相对来说差一些，分界不是特别清晰，但是也能看到白膜层，Axis-shield公司的我用下来是最喜欢的。用15ml的塑料离心管，50ml的塑料离心管及10ml圆底的玻璃管都做过，做下来的效果是玻璃管最好，15ml的塑料其次，50ml的塑料离心管是最差的，分界不是很清晰。当时离心时应该是没有用刹车。希望对你的实验有帮助。

作者: 小公 时间: 2013-8-1 10:39

回复 Life_Tech 的帖子0 s7 w/ O @5 V
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你好，是的，是没有刹车的，都设置为0，请问你是血和PBS 1比1 稀释之后，再加分离液分离的吗？

作者: evial 时间: 2013-8-2 12:42

我们不用稀释，直接加，照分离液说明书操作，连外周血也能分离到单核细胞呀。

作者: evial 时间: 2013-8-2 12:44

为啥很多人做实验时不先看看每个试剂的说明书呢？是英文不好还是不在乎？每个试剂老外都有自己的设定操作条件，照做就是了，老外的东西都是经过自家摸索条件后提供的标准方案，除非哪家杂志发表了新的更好的方案。

作者: 小公 时间: 2013-8-3 22:32

回复 evial 的帖子; u" w1 T2 B! n1 M) ?7 a- c1 S% D9 O

你好，请问你什么分离液？ficoll 还是picoll。多少血？

作者: Life_Tech 时间: 2013-8-6 14:58

回复小公的帖子1 I9 x- X. I: Z# s# ~! ~( \# w( X

我以前做的时候是买的采血袋收集的脐带血，采血袋里面本来就有液体，所以没有再用PBS稀释。你可以问问用其他方法抗凝的人是否有稀释过。

作者: deshenglll 时间: 2013-8-6 15:11

回复小公的帖子
9 z$ U, `" W# F+ S! A. j6 C% z
血的质量咋样?还有就是淋巴分离液和血的比例是不是不对啊?

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