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标题: 自体CIK细胞制备流程与规范（在设计方案中） [打印本页]

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作者: 壹DD    时间: 2013-4-18 10:24     标题: 自体CIK细胞制备流程与规范（在设计方案中）

自体CIK细胞制备流程与规范 希望大虾及用心者给予指点[attach]51075[/attach]
/ Q" Q! |, Z* W! Y: ^) p: s) z一、名词解释
: Y4 e, T  d* y) t! V2 j' u（一）肝素瓶：10ml 0.9%注射用生理盐水+4000IU注射用肝素钠，100ml 0.9%注射用生理盐水瓶存放。  k5 t7 P; {% w
（二）完全培养液：临床用无血清培养液（AIM V）+2%～5%自体血清+160IU/ml注射用硫酸庆大霉素。（为什么操作流程中没有用到这个？）) N! P( O" E/ o) z9 }/ \
（三）CIK培养液：含临床用无血清培养液（AIM V）+2%～5%自体血清+160IU/ml注射用硫酸庆大霉素+500～1000IU/ml IFN-α。（为什么操作流程中没有用到这个？）9 {% n, U. ~( Z$ N+ f, D* v2 ^
（四）CIK扩瓶培养液：含临床用无血清培养液（AIM V）+2%～5%自体血清+160IU/ml注射用硫酸庆大霉素+500～1000IU/ml IL-2。（为什么操作流程中没有用到这个？）3 _8 ^1 O' i5 a2 I5 c& n7 E, C
（五）CIK混合因子：临床用无血清培养液（AIM V）（多少毫升？）稀释于15ml离心管中，含IL-2和IL-lα（多大的量？），于冰箱-20℃保存。
5 U+ U7 A" V% G& B4 V二、CIK细胞制备% P5 c! Z# w; r
（一）患者在病房由医护工作人员抽外周血50～60ml，收集于肝素瓶中，室温或37℃存放。
6 M' R* _  {! X4 h" T（二）在超净工作台正常工作状态下，用2支50ml离心管分别装20ml的淋巴细胞分离液。& t* s2 c! q5 K( J- E6 D& ]
（三）用玻璃毛细吸管将病人外周血均匀注入于离心管中的淋巴细胞分离液液面上层，每支离心管加30ml外周血。" w+ J( D9 e' r: x
（四）高速低温离心机离心，20℃，800g离心15min。& |/ N2 w& `7 ~1 ?
（五）使用负压器吸掉离心后分离管中的血浆层大部分血浆，收获分离所得的淋巴细胞层细胞于另一支50ml离心管中。% L( d; q# }8 p# o) s
（六）用适量含庆大霉素160IU/ml的注射用生理盐水（500ml生理盐水+8万单位的庆大霉素）加满到50ml，混匀，20℃，1800～2000r/min离心8min，洗涤1～2次。" O, p$ B/ ~1 U4 ~
（七）离心洗涤后，吸掉上清液，移入175cm2培养瓶中(加哪种培养基?)，置于饱和湿度（具体多少湿度？）、37℃、5.0% CO2培养。, W* p0 s* ?4 E2 k# M
（八）培养24h加入CIK混合因子液1ml，终浓度为50～100ng/ml Anti-human CD3（前面所提的CIK混合因子配方中为什么没有这个成分？）、50～1000IU/ml IL-2、0.5～1ng/ml IL-1α，继续于饱和湿度、37℃、5.0% CO2培养。
8 F% W: H- V: L1 {（九）第5天，观察细胞生长状态，将培养CIK细胞的175cm2培养瓶，传代扩瓶到2个175cm2培养瓶中，125ml/瓶，置于饱和湿度、37℃、5.0% CO2培养。（1.传代用什么样的培养液？2.传代是根据什么来判断?）
- q; V7 r1 t! |! c4 q, t7 T* ]' N$ H（十）第7天或第8天，观察细胞生长状态，由原来的2个175cm2培养瓶传代扩瓶到4～6个175cm2培养瓶中，125ml/瓶。（传代用什么样的培养液？）
; D& j5 c. E* e4 q1 w; G/ M" T（十一）第9天或第10天，观察细胞生长状态，由原来的6个175cm2培养瓶传代扩瓶到12个175cm2培养瓶中，125ml/瓶。（传代用什么样的培养液？）! t" M3 ^/ H/ Z6 L0 z5 `# t6 U
（十二）第11天或第12天，观察细胞生长状态，抽样于15ml离心管中，1ml/瓶（送检），将CIK细胞由原来的12个175cm2培养瓶传代扩瓶到24个175cm2培养瓶中，125ml/瓶；详细填写好验单项目后，送检验科细菌室做细菌、检测。
% M9 m+ b) Q: `) w: N; r& R' v（十三）第14天或第15天，检查检验科的细菌、检测结果是否为阴性。仔细观察细胞生长状态后，随机均匀抽样5ml，台盼蓝染色法计数活细胞、死细胞总数量；并在收获前1h抽样进行内毒素检测，如为阴性可收集24瓶细胞于50ml离心杯中，2500r/min离心8min收集。
' H& Z9 l/ h3 E2 |' e3 `" ^5 O（十四）离心收集后，吸掉上清液，并将细胞收集到4支50ml离心管中，用0.9%注射用生理盐水平衡每支离心管容量，2000r/min离心8min清洗收集。) q; P- O! w6 c" J) u
（十五）离心收集后，吸掉上清液，并将细胞收集集中到2支50ml离心管中，用0.9%注射用生理盐水平衡每支离心管容量，2000r/min离心8min清洗收集。
5 |- A9 c  k" |& ^7 C3 Z, @（十六）离心收集后，并将细胞收集到约100ml 0.9%注射用生理盐水中，用5ml注射器抽取5ml 20%的人血白蛋白注入到细胞悬液中(加白蛋白的作用是?)。用刻度吸管抽样1ml细胞悬液于玻璃安瓿中，封安瓿口，做标识，-4℃存放3个月备查。(最终可以得到多少的细胞数量? )
& q0 ^4 b# P( C! t三、安全回输2 @6 j" _3 E* Q7 N6 |# M1 X
（一）将完成的细胞悬液封好瓶口，核对好病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确定准确无误后，贴上标签，送病区进行回输；同时填写好详细实验记录并签名后存档。, N% C& W0 c$ U0 p. T8 M; m$ }" O  _$ |
（二）极少数的病人偶尔会出现CIK细胞难以激活或出现CIK生长较慢的情况，可视细胞生长的实际情况适当调整传代扩瓶的速度、扩瓶的间隔时间及回输的日期。[attach]51075[/attach]
2 g$ g: q- X" t  m

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作者: cantonchn    时间: 2013-4-20 14:51

/ U7 M& T2 x! _2 s1 u+ y

" B( |- a; _. ~" T5 j7 T这是制备流程，补充一下前后的工序，即采血和回输：. w: p, S7 M  [

& y' t+ Y+ c$ q
) g+ c: s9 Z% @& e% w4 U3 j/ l一、        采血：$ {7 S) o$ |* x1 }
1.        采血前工作+ S) Q8 w$ s8 C0 F
(1)        填写细胞培养通知单和患者知情同意书：
- ^8 |, h6 g/ g5 A2 n0 E) c(2)        患者提供的化验结果：1 a* O5 X! f" k+ e1 _. Z5 l
(3)        医生提供的治疗方案：
" p9 L3 @5 [" o* X7 K* y, a& I+ k- y(4)        采血时间的确认
* N# B  s* Z# Q- [* j9 u(5)        患者缴费
- Q& O. H/ y$ `5 F/ d5 x2 a; v(6)        采血量确认  ~. m3 X3 _8 w& c4 y/ R3 {
(7)        病人采血前注意事项* O) w2 U& R$ v$ }
2.        采血用具的准备
" C/ ]# o0 m7 X- ^( f  c: P4 ?3.        采血
- ^" E: T; u( S& i二、        采血相关记录文件+ T& ~8 U  u/ [$ D* [5 u& c  H
1.        治疗申请单( e1 c, S* D% A- ^$ I/ Z4 [, T
2.        培养回输计划表, T7 ]9 l( `: i7 F
3.        知情同意书
( Q6 d. H# ?# X! B+ X0 ?* W6 H7 I三、        回输：
* H) X  b4 K, l6 c1.        回输日期的通知和确认8 [' }* ~( }2 ^3 L& M  m% j
2.        EAAL细胞的包装和质量检验单3 g7 J' p8 S: Z$ `3 W5 s: J; S% `4 C
3.        CIK细胞的运输
" e' [, r- W/ H5 n/ k. p" y4.        CIK回输
) [- d& ^/ `' d! [

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作者: lyj-0017    时间: 2013-5-18 14:41

很详细，学习了

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作者: wenwen1228    时间: 2013-5-28 22:57

回复 壹DD 的帖子
- {7 _' q: z4 X* T- o
& u, M6 k6 l8 e- g; i/ t  S8 u# \加庆大霉素的目的是什么?谢谢!

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作者: ljl1988115    时间: 2013-5-29 08:54

还在用培养瓶吗，现在主流一点的都用细胞培养袋了

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作者: zhang0194    时间: 2013-6-2 11:47

回复 ljl1988115 的帖子5 y/ G5 |# \. a# G! ]

- |$ N, D4 c* R# X; [7 y/ l开始刚分离出来的时候，总体体积很小。一般到7天才转袋.

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作者: ljl1988115    时间: 2013-6-3 10:23

回复 zhang0194 的帖子
# }. j6 C* E/ }  ?$ W: x: h6 S! y0 J- v. @* x+ U; J
仔细看他的实验步骤，他不用培养袋，最后是24个培养瓶

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作者: song0610    时间: 2013-6-5 18:50

学习了

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作者: zhang0194    时间: 2013-6-6 09:27

回复 ljl1988115 的帖子+ z. e6 g0 z6 \: i
9 y3 n; B9 H2 K. b
谢谢！

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作者: xiaolong    时间: 2013-6-6 10:29

回复 壹DD 的帖子
& u( z  B- p/ X, B( n1 r2 C' p& ~! @
你这瓶子是平放培养还是竖起来培养？感觉培养CIK好麻烦啊，发细胞时24个瓶子要操作及加液，哎……那个老兄咋不坐着观察细胞？

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作者: chslyx    时间: 2013-6-6 13:23

我想问问，这外周血第一步不是离心？我怎么看到直接将外周血加到细胞分离液上呢？

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作者: chslyx    时间: 2013-6-6 14:15

为什么外周血第一步不是离心，而是直接加到细胞分离液上呢？

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作者: 蓝O海    时间: 2013-6-6 14:30

我认为cik细胞的培养瓶横着放比较好吧，他的面积增大了，从而认为悬浮的效果也好。
- e. `7 ]. H! g# Y: F9 h" d1 N$ k

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作者: 蓝O海    时间: 2013-6-6 14:32

还有就是上面给的流程里，用生理盐水洗的时候转速有点高，1200rpm，10min即可。洗俩次。

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作者: mmssyyee    时间: 2013-6-17 16:16

同问，加庆大霉素有什么作用啊？用于临床的话可以加这个吗？

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作者: 细胞海洋    时间: 2013-6-18 09:57

回复 mmssyyee 的帖子/ m  w0 l9 x4 z2 H  H6 B

4 I% b" [+ U5 X# J  N, l0 H建议你发新帖提问

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作者: chslyx    时间: 2013-6-19 12:44

回复 mmssyyee 的帖子
' f: S" ~2 |+ h
+ v6 ?% j- @& C- {- V: \# G, i个人觉得主要是抗菌作用，防止污染

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作者: mmssyyee    时间: 2013-6-20 10:02

回复 chslyx 的帖子
1 ?  f4 `2 B& ~; e  k
- I7 B0 C9 L! M, k% R4 q* _' t! _谢谢啦。

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作者: tingwuyu    时间: 2013-7-2 17:03

学习了

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