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标题: 为什么5%脱脂奶封闭需要洗，而BSA、血清不需要洗呢 [打印本页]

作者: 请叫我晓白 时间: 2013-4-26 00:59 标题: 为什么5%脱脂奶封闭需要洗，而BSA、血清不需要洗呢

最近做心脏免疫荧光，一抗是生物素标记的，二抗用cy3-亲和素。发现阴性对照没加一抗（一抗也不是染心肌的）心肌全染上色了。因此考虑封闭内源性生物素，准备用鸡蛋清洗后加5%脱脂奶（含吐温20 0.1%）封闭。
因此我想提的问题是：! |% ^$ {- h1 v! l; a7 D1 @
1.用脱脂奶封闭后是否需要PBS洗，为什么血清、BSA不需要洗？
2.脱脂奶封闭后或者封闭前是否还需要用血清或BSA封闭？& n/ h( f: e( t5 K" A6 z
3.问了很多高手都没用过我的这种生物素标记的单克隆一抗，我染的抗原很稀少，请问我选择的一抗、二抗是否有错误？
4.如果我做加做双标染心肌，另一种一抗是兔抗大鼠a-SA，二抗是羊抗兔FITC。那么我还可以继续用5%的脱脂奶封闭，然后洗，不用山羊血清或BSA封闭吗？, ?8 z6 ^% |5 G1 A+ u/ Q# Y6 O; A
急盼各位高手解惑啊

作者: yuhaoze 时间: 2013-4-26 07:58

1.用什么封闭液要看你的实验设计，脱脂奶粉不适合研究磷酸化，因为奶粉里面含有激酶和磷酸酶，BSA成分单纯，理论上最好，但是实际效果不一定。1 ~9 G6 Y7 ? d
不管是用什么封闭的，最好都要洗。如果你的一抗稀释液跟你的封闭液一样，也可以不洗，效果不一定好。1 e0 A8 ^* k& f; X
2.用一种封闭液就行了" R1 e( _ W9 I2 W0 |2 Z
3.很多“高手”都没做，说明你做的事情是独特的，建议你去英文文献里面找找，类似你的实验，别人都是怎么做的，照着做就行了。
4.脱脂奶粉和血清成分不确定，如果跟你的抗原或一抗反应，就不能用。

作者: weiyepan 时间: 2013-4-26 11:21

哺乳动物细胞生物素化背景很低的。亲和素抗体浓度用太高了吧，那东西分子量是抗体的1/5，结合能力又比一般抗体高，你再往下稀释1~2个数量级做做看？

作者: 请叫我晓白 时间: 2013-4-26 14:07

weiyepan 发表于 2013-4-26 11:21
/ K" M) c/ \( ~8 k0 ^7 i5 W4 z哺乳动物细胞生物素化背景很低的。亲和素抗体浓度用太高了吧，那东西分子量是抗体的1/5，结合能力又比一般抗 ...

可是我的阴性对照连一抗都没加，全给染上了，而且是背景很好，这种情况是不是肯定发生了结合反应呢？如果没加一抗，那亲和素的浓度影响不大吧？

作者: 请叫我晓白 时间: 2013-4-26 14:10

yuhaoze 发表于 2013-4-26 07:58 . L' V5 _# N# R
1.用什么封闭液要看你的实验设计，脱脂奶粉不适合研究磷酸化，因为奶粉里面含有激酶和磷酸酶，BSA成分单纯， ...

我的实验不研究磷酸化，只是染心脏一种细胞膜上抗原
“不管是用什么封闭的，最好都要洗”啊？为什么所有免疫荧光的步骤都说BSA或血清封闭不洗啊？

作者: weiyepan 时间: 2013-4-26 14:34

本帖最后由 weiyepan 于 2013-4-26 14:36 编辑
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回复请叫我晓白的帖子; X. w4 r1 M; N% n' r

我说的是亲和素的非特异性结合，是因为加的浓度太高了，连没有生物素化的蛋白都结合上了。这种情况在WB里面出现特别明显，和一抗没关系。+ u0 k; @ s7 g) a
另外建议你的做法是低浓度亲和素低温孵育过夜，如果是压片做的话，二抗里面也加一半浓度的封闭剂，不然的话背景高的很离谱的。
FYI：封闭剂洗不洗是个人习惯，我是觉得没必要洗，如果封闭剂里面有抗原的话，换一种封闭剂就行了，和洗不洗的干净根本没关系。

作者: 请叫我晓白 时间: 2013-4-26 16:05

weiyepan 发表于 2013-4-26 14:34 5 L5 ^# D3 z; u
回复请叫我晓白的帖子
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3 \6 d s/ F! A& _2 Z我说的是亲和素的非特异性结合，是因为加的浓度太高了，连没有生物素化的蛋白都 ...

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多谢。我上次用的5%BSA封闭，抗体稀释液是1%BSA+0.3%triton。我这次准备用蛋清、脱脂奶封闭内源性生物素，然后用BSA封闭，试试结果。多谢你的帮助

作者: weiyepan 时间: 2013-4-27 10:42

回复请叫我晓白的帖子& g" E; S# w# d( t0 u
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感觉没有办法封闭内源性生物素。生物素是小分子，是特异和亲和素结合的。8 Z, @+ V2 Q1 M* _) x: A
而且我感觉你用的二抗是streptavidin而不是avidin，streptavidin是四聚体，不能用于封闭。除非你能找到有单体的没有标记的抗生物蛋白，那你的背景才能封掉。

作者: 请叫我晓白 时间: 2013-4-27 14:04

weiyepan 发表于 2013-4-27 10:42 : c3 d4 s% f# p" f9 a; M
回复请叫我晓白的帖子
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# J, s* K! w* R* y% _感觉没有办法封闭内源性生物素。生物素是小分子，是特异和亲和素结合的。

的确是avindin的二抗而不是streptavidin。这个是博士德公司的不会搞错。我看了很多参考文献都说可以用蛋清封闭生物素，这几天造模下周切片再试试

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