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标题: 推荐给大家一篇好的小鼠精原干的文章，12年10月份的，但是很好 [打印本页]

作者: 我爱火热的冬天 时间: 2013-5-18 22:18 标题: 推荐给大家一篇好的小鼠精原干的文章，12年10月份的，但是很好

这篇文章发表与cell stem cell，是由Kanatsu实验室发表的，讲述了小鼠精原干细胞龛环境的构建，本文思路借鉴于造血干细胞的成熟理论的研究，现就其内容做一下简述，如有疑问以及想法，大家一起讨论，我也只是理解了一部分，望见谅。

干细胞龛(the stem cell niche)是成体干细胞的集中存储部位,通过特定的细胞外基质和龛细胞提供特殊的微环境,对维持干细胞的高增殖力和诱导定向分化起关键作用。因此，龛必须提供因子维持干细胞，并排除那些发生分化的干细胞。! a- i; S, [. y) ?+ z
精原干细胞是一群能够自我更新并具有多向分化潜能的永生细胞.“干细胞龛”理论最初是在造血系统中提出来的,龛同样也存在于睾丸组织中.精原干细胞龛在睾丸中是半开放的隔离体系,具有特定的数量调控及随年龄变化的特征.果蝇生殖龛由于其具有简单的结构而得以进行了详细的分子分析（ Spradling et al., 2001 ）。但是，在哺乳动物中，组织的自我更新一般更加复杂，关于龛和如何维持其干性仍有很多未知。两种内源性因子nanos2和Plzf调控精原干细胞自我更新.龛细胞分泌因子胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)也调节精原细胞的更新2 z8 Z- V* q; x8 H& H( {
  SSCs的鉴定依赖于它们的自我更新，而不是形态。1994年，用于研究SSCs的移植实验方法建立（ Brinster and Zimmermann, 1994 ）。当把SSCs显微注射到不能生育的睾丸曲精细管里， SSCs重新开始发生并在很长的一段时间维持精子的发生。移植的SSCs依附在支持细胞上并通过支持细胞间的紧密连接由近腔室向管基膜迁移。 SSCs之后再拓殖出位于基膜的空的龛（ Nagano et al., 1999 ）。 SSCs和龛的联系是很活跃的，即使把大量的SSCs移植入未经处理的野生型环境中也能产生定植（Shinohara et al., 2002 ）。 SSCs的移植技术不仅提供了一种有效的实验方案还呈现了SSCs的回巢活动。
  建立睾丸饲养层细胞培养系统用于鉴别SSC趋化因子。当把SSCs接种到来自不能生育的小鼠的睾丸细胞， SSC s迁移到支持细胞下面并形成鹅卵石状的克隆团。培养的细胞可以保持至少5个月的SSC活力并具有生育能力。鹅卵石状的克隆团的形成依赖于GDNF和CXCL12，显性负GDNF受体转染或者CXCL12受体缺失会减少SSC定植。另外，GDNF上调CXCL12受体表达， CXCL12在支持细胞的转染能够提高回巢率。小结：我们的调查结果证实GDNF和CXCL12在体内和体外可作为SSC趋化因子
  2000年，GDNF被鉴定为SSCs自我更新因子（ Meng et al., 2000 ）。在过表达GDNF的转基因小鼠内，未分化的精原细胞群在生精小管内累积，相反，在GDNF敲除的杂合子小鼠中精原细胞减少或者小鼠不育。另外， SSCs体外增殖必须添加GDNF（ Kanatsu-Shinohara et al., 2003）。尽管发现了很多，但是对于龛的统一和位置的确定仍然没有弄清楚。例如，在一个研究中SSCs被认为位于离血管很近的生精小管区域（Yoshida et al., 2007），但是例外一些研究认为不是血管的位置而是支持细胞的数量指示这龛的分布( Oatley et al., 2011 ) 。在体内研究SSCs龛相互作用的困难之处部分原因是由于不能通过他们的形态进行鉴定3 B4 S0 K% j1 `5 X3 V  y# [  P
尽管移植实验是检测SSCs可依赖的方法，但是只有在移植6周后才能发现稳定的集落，而且在定植的早期很难区分祖细胞和SSCs，使得在原位置定位龛的位置难上加难，这是因为缺少SSCs专能性标记。事实上，只有5%-10%的As精原细胞通过移植后具有SSCs潜能。; B. |& C' G* s( x* {
在哺乳动物中，干细胞和龛之间的相互作用已经在HSC被广发的研究，比如在体外成功构建干细胞的微环境( Dexter et al., 1977 )。
1.在睾丸饲养层上生殖干细胞鹅卵石状的形成6 q! o" `: P; v7 c2 |- I+ \2 g
为模拟曲精细管内环境建立了睾丸细胞培养体系。睾丸细胞来自先天不育的WBB6F1-W/WV ，由于酪氨酸激酶框突变造成分化生殖细胞过程的缺失从而达到富集支持细胞的目的。睾丸细胞用加有EGF(E),FGF2(F)和FGF9的无血清培养基在曾粘蛋白包被的皿中培养。该饲养层用于联合培养前用丝裂霉素C（MMC）处理。生殖细胞来自C57BL/6 Tg14(act-EGFP) OsbY01 (Green) 小鼠，加入EGF, FGF2,  GDNF (G)， 1%FBS在饲养层上培养。
在联合培养7-14天，一些细胞迁移到饲养层下面，而其他细胞在饲养层上成块存在。前者在联合培养7天后占总集落的12.3% ± 0.6%（n=12），这些细胞类似于造血干细胞鹅卵石集落，核明显，细胞边缘清晰，视野中颜色比较暗。后者类似于在MEF上培养的那些细胞，细胞之间边界不清晰，类似于桑椹胚。* e% P$ O: _2 F+ @( S& H
2.从睾丸细胞富集的SSC形成“鹅卵石”4 \" P  ^1 }) V, G; ]# A
因为生殖系细胞没有必要呈现睾丸内SSCs的相同特性。我们下一步检测从睾丸中新分离的SSCs是否具有形成“鹅卵石”的能力。采用抗ITGA6抗体从12-16天或8w的绿色小鼠中收集SSCs。  p) u" Q: c6 g2 h5 Z' D& |, \
小结：“鹅卵石”的形成不仅可以在GS细胞也可以在从幼鼠和成鼠分离的睾丸细胞中发现。: N$ J6 k" A; o8 I
  3.通过GDNF和CXXL12提高“鹅卵石”形成活力的增加, y" i* I( \5 B$ n0 ~2 J* Q
  为了理解“鹅卵石”的形成机制，我们对比了在GS细胞形成“鹅卵石”活性中细胞因子的作用。除了GDNF、EGF和FGF2，我们探讨了能够在体内睾丸中诱导GDNF表达的FSH的影响。
   1、只添加G诱导“鹅卵石”形成显著高于EF,但是EF的低数量可以明显的通过添加FSH来提高，尽管FSH自身不诱导“鹅卵石”。
   2、比较KITL和CXCL12对“鹅卵石”形成的影响。在EF+FSH的情况下添加CXCL12增加“鹅卵石”的数量，而KITL下调“鹅卵石”接近0.7倍的数量) |6 m: E# @* N3 [7 h2 O7 s5 ~  a
   3.在EF+FSH的情况下加入GDNF中和抗体能够抑制“鹅卵石”的形成，但加入KITL中和抗体没有任何影响。这表明在EF+FSH的情况下加入GDNF能够促进“鹅卵石”的形成。% E; o( F: R# p8 H4 _- [
   4.相反，在EF+FSH的情况下加入能够抑制CXCL12绑定受体CXCR4的AMD3100不能抑制“鹅卵石”的形成。但在EFG情况下能够抑制表明：在EFG情况下“ 鹅卵石”的形成部分依赖于体系中产生的CXCL12。0 z# p# S- y( w
   5. ELISA结果显示在培养体系上清中CXCL12表达显著高于GDNF表达水平。在EF情况下GDNF和CXCL12的表达增加。然而，GDNF和CXCL12都不能互相上调其表达量。进一步来说，FSH也不能影响这些细胞因子的表达，表明：这一过程涉及其他分子。
4.在“鹅卵石”培养体系下SSC活性的长期维持5 d# p% h4 p2 x& r6 l, R! P& o; t
为了决定培养的细胞是否维持SSC活性，我们收集了培养期间的部分细胞，培养5个月后移植入W小鼠来测量SSC的活力。% h# K' W( g, ?0 ?9 c( d0 s
5、Cxcr4-KO小鼠SSCs归巢数的减少1 B: {8 e1 q9 H7 t2 P" K
基于我们在体外的观察，我们假设CXCL12和GDNF参与在体内SSC的归巢。首先我们检测在SSC归巢中CXCR4的关联性。尽管CXCL12在支持细胞中表达，但在As或Ap ZBTB16+精原细胞也表达，而且比Aa表达强
6.Ret突变减少“鹅卵石”的形成和SSC归巢7.Cxcl12转导受体睾丸能促进SSC的植入( B; k( F6 S  N; e- ?5 K4 |
讨论
1.建立了能长期维持SSCs“鹅卵石”形成的睾丸细胞培养方法- u" W$ a$ D, m$ Y9 U" ]
2.GDNF，EGF+FGF2能够增加“鹅卵石”形成，当添加FSH到EF组能够更进一步增加“鹅卵石”形成。在EF组能够增加GDNF的分泌，但添加FSH不能促进GDNF水平的增加。因此，FSH可能是间接的通过其它自我更新因子对“鹅卵石”形成产生影响。! A4 @8 ?/ g% j! F# I
这一见解也可以通过观察来自C57BL/6（B6）睾丸的SSCs，这些SSCs在MEF上不能增殖，但在睾丸饲养层上培养能够形成“鹅卵石”
3.添加AMD3100会抑制“鹅卵石”，故CXCL12可以作为候选分子。然而，添加CXCL12或者 AMD3100不影响GS细胞的增殖，加入FSH后GDNF和CXCL12的水平也没有增加。
4.在MEF中添加CXCL12，B6生殖细胞没有增殖，证明了涉及其他因子。
5.值得一提的是在培养系统中没有加外源FGF2，GDNF促进了SSC的增加。尽管在铺有曾粘蛋白的SSC的增殖必须要有GDNF和FGF2,但是

5 }* K7 q$ ^9 f6 ~3 T' N
以上是我自己看了这篇文章后的总结，也是自己对这篇的理解，对于里面很多的实验内容并没有说太清楚，大家自己下了文献可以仔细研究，如果看了也可以一起讨论，也希望大家看了好文章和大家一起分享，同时祝愿生殖干细胞专区越来越火。

作者: 490096812 时间: 2013-5-19 21:07

我看完后跟你，请教请教

作者: 我爱火热的冬天 时间: 2013-5-19 22:05

我也有几个地方不懂，互相交流哈

作者: w343989328 时间: 2013-5-20 21:22

师兄给力哈。0 B3 ? h7 q, M
第一次看到这篇文章的标题以为能够做到in vitro的分化，结果哈~4 {5 k& U6 K- i# m1 S
这篇文章中，重构的niche中，SSC有两种形态，即鹅卵石型和clump型；从解剖学上，As是定位于sertoli细胞下的。那么，有个疑问，是否鹅卵石型的细胞才是As细胞，而clump型细胞是往下开始分化的细胞Apr和Aal。但是，这篇文章中的曲细精管移植证明了鹅卵石型和clump型具有同样的SSC活性。是否是因为这几类细胞在in vivo的环境下可以发生相互转变所致？

作者: 我爱火热的冬天 时间: 2013-5-21 09:53

其实他做的实验室在体外重构的，也就意味着clump型和鹅卵石型是在体外形成的，对于鹅卵石型和clump型是什么类型的细胞不能单纯的用在体内的那个分类来简答划分吧，根据他的实验，clump型是具有SSC活性，并具有形成鹅卵石型的能力，niche产生ssc以及ssc回巢形成新的niche证明具有一定的可逆性。在体内的移植实验只是用来证明其ssc活性的，在体内这几种细胞能否转化，他这里提及的不管上面还是下面的细胞都是SSC，我不知道ssc的具体定义只是指As还是也包括Apr和Aal，如果包括的话，说明在体内部分细胞可能在趋化因子的作用下回巢，形成新的龛。最后的那张图片画的很形象，很生动，可以仔细研究研究。

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