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标题: 使用pEGFP-N1构建重组过表达载体问题求助 [打印本页]

作者: yangcy-smile 时间: 2013-6-3 13:31 标题: 使用pEGFP-N1构建重组过表达载体问题求助

目前，我想把一个ORF约1.3Kb的基因克隆至pEGFP-N1载体中，载体说明中说假如使插入基因与载体自带EGFP标签构成融合蛋白表达，要去掉基因中的终止密码子，现在问题是
（1）去掉终止密码子的话是不是插入基因会一直通读至EGFP标签至EGFP的终止密码子，那这样的话EGFP与酶切位点之间的序列是否也会被每三个碱基一起被编码成蛋白，从而产生移码突变的问题？$ L* w0 H5 _) k% B
（2）另外在设计引物时，在插入基因的ATG前面是否需要加入Kozak序列？望众位大虾指导

作者: ljzmy82 时间: 2013-6-3 13:54

去掉终止密码子后插入基因会一直通读至EGFP标签至EGFP的终止密码子，并不是有终止密码子就会停止翻译，还必需要有终止序列的帮助，才能终止蛋白质的翻译，另外只要保证插入的序列是3的倍数，是不会发生移码突变的

作者: eley 时间: 2013-6-3 15:09

如果想加Kozak序列的话，那就加上吧，反正我自己做的时候加不加表达都差不多~

作者: yangcy-smile 时间: 2013-6-3 15:23

回复 eley 的帖子" T; ~. u P5 n0 V; E
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很谢谢您的回答那在设计载体的时候，把目的基因的终止密码子去掉了吗？考虑移码突变的问题了么？

作者: yueweilei 时间: 2013-6-3 21:43

(1) 想要和GFP形成融合蛋白，需要去掉目的基因的stop codon，需要考虑ORF是否移码的问题。0 D7 T0 q O, t. P
(2) 可以加Kozak sequence

作者: eley 时间: 2013-6-4 15:22

回复 yangcy-smile 的帖子

当然要去掉了，也要考虑移码的

作者: mzaq2006 时间: 2013-6-4 22:27

PEGFP-N1是真核表达载体，一般需要加Kozak sequence。如果要和后面的EGFP融合表达，构建时需要去掉基因的终止密码子，而且要保证基因的最后一个密码子到EGFP的ATG之间是3个倍数。

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