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标题: 关于EB的形成与克隆的挑取 [打印本页]

作者: your1024    时间: 2013-6-5 16:15     标题: 关于EB的形成与克隆的挑取

请教一下各位:
  u5 c6 `4 M& E* k* A0 T4 V- S! e1、如果用悬滴法形成EB的话,是使用纯的ES/iPS来进行的么?细胞量大概在多少呢?那MEF是如何消除干净的呢?" }9 v. N7 X! R) g2 q; p
2、如果直接用悬浮法的话,就是把细胞消化下来直接接种到低附皿里就可以了么?是单细胞悬液么?MEF不需要清除么?" f( ~- ?1 G9 c5 X3 T' M
3、还有在细胞克隆形成的时候,如果需要把克隆挑取出来,各位是用的什么设备呢?普通的体式显微镜能够看到么?还是需要什么特殊的配件才可以?; R: l% R- ]7 D$ T8 H: R& M
谢谢各位!
作者: canyon    时间: 2013-6-19 10:43

这是小鼠的还是人的iPSCs?人iPSCs用悬滴法不太适合。
作者: nichifanlema2    时间: 2013-6-20 17:26

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/ Y' j; a, K+ D% ^/ u2 S/ D要是人的ES或者iPS的话,消化后吹打成比传代克隆稍大的克隆,收集到离心管,静置一段时间除去上清后,加无bFGF的培养基重悬,转移到国产的细胞培养皿悬浮培养4-6天即可。
作者: cn8867567    时间: 2013-7-12 11:01

1.去除MEF细胞,你可以把消化的细胞,先置于细胞培养皿中37℃培养半个小时,残余MEF应该都贴壁了,将细胞悬液吸出,用这个悬液形成EB。
$ Q' t, L8 @6 p0 h2 l+ o+ a2.如果是小鼠的ES/iPS,消化后是单个细胞,悬液制成(1-1.5)*10^5/ml,20μl形成一个悬滴。悬滴培养2天后,转移到petri dish中悬浮培养。
作者: cn8867567    时间: 2013-7-12 11:03

挑取克隆就是用体视显微镜,但是你的显微镜是在相应超净台中的吗?如果不是,你就需要注意防止污染的问题了!
作者: your1024    时间: 2013-7-18 19:57

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想在请教一下,EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么?我总是不能让EB很好的贴壁,要么是看着已经贴了,加液之后又重新悬浮起来;要么是放的时间长了,细胞都死了(本身带GFP的细胞,淬灭了),我用的孔板,事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢?还想问下,如果做WB或者PCR的话,6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢?谢谢!
作者: your1024    时间: 2013-7-18 19:57

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想再请教一下,EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么?我总是不能让EB很好的贴壁,要么是看着已经贴了,加液之后又重新悬浮起来;要么是放的时间长了,细胞都死了(本身带GFP的细胞,淬灭了),我用的孔板,事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢?还想问下,如果做WB或者PCR的话,6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢?谢谢!
作者: canyon    时间: 2013-8-11 01:39

1- 贴壁第一天可以使用20%FBS,半量培养基,贴牢后再补加;
9 y( [- p* J2 P* V2- EB球的数目,尽量多些吧,目测应该在100个以上才安全些。
作者: echoxy1020    时间: 2016-8-9 04:38

回复 nichifanlema2 的帖子1 D- r# E! J+ P

  q; G* Z4 S3 ^. ?$ K/ C4 i您好,新手一枚,您说的这个方法是指把克隆吹打成小碎片,然后放在培养液里4-6天后即可自然形成EB吗?我最近在做用人ips细胞形成EB,方法是用EDTA消化掉滋养层细胞,然后收集ips细胞制成悬液,加到96孔板离心,原则上应该24小时后就可以形成EB了,但不知道为什么总是不成功,不知道您有无相关经验,请赐教,谢谢!
作者: nichifanlema2    时间: 2016-8-9 08:41

回复 echoxy1020 的帖子; l: y5 v6 |" j+ l
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EDTA消化后的克隆非常小,甚至都会成为单细胞,这样细胞会非常容易死掉。另外,EB体外形成一般用悬浮培养,用96孔板稍麻烦一些,即使没有包被,也会贴壁,只是贴的很不牢,慢慢都死掉了。小克隆或者单细胞的悬液,悬浮培养做EB时,可以尝试加Y,或者商业化的EB形成培养基,价格没那么贵,效果会好很多。
作者: echoxy1020    时间: 2016-8-9 16:23     标题: 标题

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2 P8 g  S) q! h9 D1 z7 ]% p非常感谢!我查了一下,悬滴法和悬浮法应该是不同的吧,哪种更适合人ips呢?如果采用悬浮,培养基还是用日常ips培养的液体吗?需不需要加什么特别的细胞因子?你说的加y.y是什么?我们用的是APEL,貌似不是专门的EB形成培养基。还有就是碎片大小不一,自然形成的WB大小是不是也会不一样,而且他们会太过松散吗?不好意思,问题太多,前面的人是成功的,但我做个两个多月了还没重复出来,所以在想试试别的方法,谢谢!
作者: nichifanlema2    时间: 2016-8-10 08:40

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9 ~. J7 }; c  {/ _8 L0 H' a- F. v% U9 ]1 U  C0 Z& S
悬滴法产量太少,也不太适合人的多能干细胞,基本都会死掉,自然也不会形成EB。Y是指的Y27632,。小细胞团块形成的EB会大小不一,但是不影响后续实验,形状是典型的EB形状。




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