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标题: 请教关于EB的形成与克隆的挑取 [打印本页]

作者: your1024 时间: 2013-6-5 16:16 标题: 请教关于EB的形成与克隆的挑取

请教一下各位：
1、如果用悬滴法形成EB的话，是使用纯的ES/iPS来进行的么？细胞量大概在多少呢？那MEF是如何消除干净的呢？. A! q8 _7 W) Z X/ J! W
2、如果直接用悬浮法的话，就是把细胞消化下来直接接种到低附皿里就可以了么？是单细胞悬液么？MEF不需要清除么？
3、还有在细胞克隆形成的时候，如果需要把克隆挑取出来，各位是用的什么设备呢？普通的体式显微镜能够看到么？还是需要什么特殊的配件才可以？. k" a% _0 l3 }" P$ I$ ^% ^& ]& c
谢谢各位！

作者: zpzp0312 时间: 2013-6-6 09:11

直接消化后不必去除MEF，ES细胞会形成EB，MEF就直接分开了
如果要取出克隆，直接用10ul 的枪头就可以

作者: frankieisme 时间: 2013-6-6 10:00

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悬滴法形成EB,理论上用纯的ES/iPS.细胞数500-1000个/20ul,MEF通过差速贴壁法去除.具体方法:胰酶把细胞消化成单个细胞,之后用分化培养液重悬细胞,在事先0.1%明胶包被过的小皿中差速培养1h，大部分MEF 细胞已经牢固贴壁，而ES/iPS还没有贴壁，收集上清获得较纯的ES/iPS，计数之后悬滴培养。
细胞克隆形成之后用10ul的枪头挑选，可事先在培养皿有克隆的部位划个圈，然后再挑出克隆。

作者: your1024 时间: 2013-6-6 23:09

回复 zpzp0312 的帖子; {' l, ^. }; @
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感谢回复！

作者: your1024 时间: 2013-6-6 23:10

本帖最后由 your1024 于 2013-6-6 23:13 编辑
1 w7 Q; K( @, q; H
回复 frankieisme 的帖子* O5 k" { B9 l9 Y& `1 G! e0 r
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谢谢您的详尽回复！

作者: your1024 时间: 2013-7-18 20:03

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想再请教一下，EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么？我总是不能让EB很好的贴壁，要么是看着已经贴了，加液之后又重新悬浮起来；要么是放的时间长了，细胞都死了（本身带GFP的细胞，淬灭了），我用的孔板，事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢？还想问下，如果做WB或者PCR的话，6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢？谢谢！

作者: frankieisme 时间: 2013-7-19 23:13

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0.1%明胶铺半个小时就差不多了。EB有点抱团的习性，尽可能把EB混匀。还有密度尽可能不要太大了，EB太多了不容易贴，容易散开，6孔板一孔种二、三十个，大多数都能贴并能跳，我的经验。要做WB或PCR的话你只能多准备些板子。一般第二天换液，不能贴的也就不要了，随后根据细胞状况每天或隔天换液。

作者: your1024 时间: 2013-7-20 17:30

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" Y9 G5 w; u3 u& V' N
谢谢！我再实践一下。

作者: waterbubble 时间: 2013-9-27 14:28

我们用悬滴法做EB，hESC 每滴1X10^4个细胞 20ul

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